陳德才 王雅 馬從乾 楊軻 陳輝 陳德霞

(鄭州大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院 1血管外科，河南 南陽 473200；2腎內(nèi)科；3南陽市方城縣人民醫(yī)院血液凈化科)

高血壓、冠心病等多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展與血管內(nèi)皮細(xì)胞受損密切有關(guān)，血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致血栓的形成是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)〔1〕。氧化應(yīng)激、氧化低密度脂蛋白、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、同型半胱氨酸等多種因素都可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔2〕。氧化應(yīng)激通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞的生長，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)炎癥因子過表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)等方式損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞〔3〕。氧化應(yīng)激造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是由活性氧(ROS)介導(dǎo)的，ROS可以調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度及一氧化氮(NO)的生成，減弱血管舒張，導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損〔4〕。microRNA(miR)非編碼RNA可調(diào)控多種信號通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及黏附等過程，并參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔5,6〕。目前研究顯示，miR可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、分化及血管形成等生理病理過程。miR-23b可通過調(diào)控核因子(NF)-κB信號通路，調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子和細(xì)胞因子的表達(dá)起到自身免疫作用〔7〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，通過生物信息學(xué)的手段對miR-23b相關(guān)靶基因通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-23b可調(diào)控Notch信號通路、Wnt/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等，對其作用的靶基因的功能進(jìn)行分類，主要包括調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、參與免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)血管形成、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等功能〔8～10〕。本研究探討miR-23b對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用與MAPK信號通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料 人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)株購自美國ATCC公司，試劑：胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-23b mimic及miR-23b-mimic陰性對照購自上海GnenPharma公司；白細(xì)胞介素(IL)-1β(PeproTech，美國)；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；SYBR Green Gene Expression Assay購自大連Takara公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京森貝伽生物公司；丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化物歧化酶(SOD)試劑盒及乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購自北京博奧森生物公司；實驗所用引物均由上海生工合成；p38-MAPK抗體、p-p38抗體、Bax抗體、酶切(Cleaved)Caspase-3抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.2血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中，于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取生長良好的細(xì)胞用于實驗。實驗分為四組，空白(Blank)組：不做任何處理正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞；H2O2組：在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入H2O2，調(diào)整其終濃度為0.1 mmol/L，建立血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型；miR-23b-mimic+H2O2組：血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-23b mimic后加入終濃度為0.1 mmol/L H2O2處理；mimic-nc+H2O2組：血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-23b mimic陰性對照后加入終濃度為0.1 mmol/L H2O2處理。轉(zhuǎn)染具體步驟按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。處理后置于7℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR檢測HUVECs miR-23b表達(dá) 各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h以后，分別收集細(xì)胞，按照每10 cm2的細(xì)胞加入1 ml的Trizol，裂解各組血管內(nèi)皮細(xì)胞，再加入1/5體積的氯仿溶液，混勻后劇烈震蕩15 s，4℃下12 000 r/min離心10 min。取上清液至另一新的EP管，用預(yù)冷的異丙醇沉淀RNA，用75%的乙醇洗滌RNA，最后用RNase-free ddH2O溶解RNA。經(jīng)純度和濃度檢測后，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR Green Gene Expression Assay進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，采用20 μl反應(yīng)體系(cDNA 2 μl、正義鏈0.5 μl、反義鏈0.5 μl、2× SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl、ddH2O 7 μl)。以β-actin為參照，用相對定量2-△△CT計算miR-23b相對表達(dá)量。引物：GAPDH-正義5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反義5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′；miR-23b-正義5′-TGGGTTCCTGGCATGC-3′，反義5′-TCGTATCCAGTGCAGGGTC-3′。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs凋亡情況 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞以上述方法處理后培養(yǎng)24 h，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將各組細(xì)胞洗滌2次后，加入約400 μl的結(jié)合緩沖液混勻，吹打制成單細(xì)胞懸液，再依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕柔混勻后置于室溫中避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀測定凋亡情況。

1.5Western印跡檢測細(xì)胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax水平 各組HUVECs分別培養(yǎng)24 h以后，每孔細(xì)胞中加入適量苯甲基磺酞氟(PMSF)裂解液，置冰上孵育約20 min。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮落，收集到離心管中，4℃下12 000 r/min離心10 min。采用二喹啉甲酸(BAC)法對蛋白進(jìn)行定量。每個泳道加入40 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳，采用5%的濃縮膠和10%的分離膠，濃縮膠的電流為20 mA，分離膠的電流為40 mA，當(dāng)指示劑電泳至凝膠底部時停止。采用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，在4℃條件下以80 V電壓轉(zhuǎn)膜90 min。將硝酸纖維素膜放入5%牛血清白蛋白中，室溫下在搖床上封閉60 min。分別加入p38-MAPK(1∶800稀釋)、p-p38(1∶800稀釋)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶500稀釋)一抗4℃過夜孵育，再加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，在室溫下孵育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行顯影，用成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，用軟件分析各組細(xì)胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平。

1.6檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中過氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)活性 上述方法處理細(xì)胞后24 h，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，去掉上清培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，用PBS重懸各組細(xì)胞，通過超聲波細(xì)胞破碎儀冰浴中破碎5 s×5次，使細(xì)胞破碎，黃嘌呤氧化酶法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA含量，比色法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中LDH活性。

1.7MAPK信號通路激活劑上調(diào)miR-23b的表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs的影響 在轉(zhuǎn)染后H2O2誘導(dǎo)處理HUVECs 24 h后，加入10 μmol/L的MAPK激活劑茴香霉素處理記為Anisomycin組。用流式細(xì)胞術(shù)測定48 h HUVECs凋亡情況，步驟同1.4。蛋白質(zhì)印跡法測定48 h細(xì)胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平，步驟同1.5。檢測48 h血管內(nèi)皮細(xì)胞中SOD、MDA、LDH活性，步驟同1.6。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR檢測HUVECs miR-23b表達(dá) H2O2組HUVECs miR-23b水平(0.64±0.07)明顯低于Blank組(1.00±0.00)(P<0.05)，miR-23b-mimic+H2O2組miR-23b水平(3.21±0.28)明顯高于mimic-nc+H2O2組(0.62±0.06)(P<0.05)，mimic-nc+H2O2組細(xì)胞內(nèi)miR-23b水平與H2O2組無明顯變化(P>0.05)；4組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=212.560,P=0.000)。

2.2miR-23b上調(diào)減少H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 與Blank組相比，H2O2組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯升高，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)。與H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平明顯降低(P<0.05)，H2O2組與mimic-nc+H2O2組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而上調(diào)miR-23b可減少H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞中Caspase-3活化，減少Bax表達(dá)。見圖1和表1。

2.3miR-23b上調(diào)減少H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷 與Blank組相比，H2O2組血管內(nèi)皮細(xì)胞中SOD活性顯著降低，MDA含量和LDH活性顯著升高(P<0.05)；與mimic-nc+H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組血管內(nèi)皮細(xì)胞中SOD活性顯著升高，MDA含量和LDH活性顯著降低(P<0.05)；mimic-nc+H2O2組與H2O2組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，上調(diào)miR-23b可以緩解H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。見表1。

2.4MAPK信號通路激活劑對血管內(nèi)皮細(xì)胞中p38-MAPK、p-p38的影響 與H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組細(xì)胞中p38-MAPK和p-p38的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與miR-23b mimic+H2O2組相比，Anisomycin組細(xì)胞中p38-MAPK和p-p38的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。說明上調(diào)miR-23b可以抑制p38-MAPK和p-p38表達(dá)，抑制MAPK信號通路激活，加入MAPK信號通路激活劑后可以上調(diào)p38-MAPK和p-p38表達(dá)，激活MAPK信號通路。見圖2，表2。

圖1 miR-23b對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及對細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)的影響

表1 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平及SOD、MDA和LDH活性比較

1)與Blank組比；2)與mimic-nc+H2O2組比:均P<0.05

2.5MAPK信號通路激活劑對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響 與H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組細(xì)胞中SOD活性顯著升高，MDA含量和LDH活性顯著降低(P<0.05)。與miR-23b mimic+H2O2組相比，Anisomycin組細(xì)胞中SOD活性顯著降低，MDA含量和LDH活性顯著升高(P<0.05)。上調(diào)miR-23b可以降低H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而MAPK激活劑可以增加上調(diào)miR-23b降低的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。見表2。

圖2 Western印跡檢測各組血管內(nèi)皮細(xì)胞中p38-MAPK和p-p38的表達(dá)水平

表2 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞中p38-MAPK、p-p38表達(dá)及SOD、MDA和LDH活性比較

與H2O2組比：1)P<0.05；與miR-23b mimic+H2O2組比：2)P<0.05

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損傷是高血壓、冠心病等心血管疾病發(fā)生的起始環(huán)節(jié)，而活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除失衡參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷過程。過量ROS產(chǎn)生會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，產(chǎn)生大量氧化中間物，引起蛋白氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷〔11〕。SOD是生物體內(nèi)非常重要的抗氧化酶，廣泛存在于動物、植物、微生物中，是清除體內(nèi)ROS的首要物質(zhì)。SOD活性的高低是反映機(jī)體抗氧化損傷能力的直觀指標(biāo)，可緩解細(xì)胞的氧化損傷并可修復(fù)受損細(xì)胞〔12〕。MDA是膜脂過氧化主要產(chǎn)物之一，MDA含量增多可加劇膜的損傷。通過MDA含量的高低可反映膜脂過氧化的程度，膜系統(tǒng)受損程度可反映細(xì)胞受損程度〔13〕。LDH幾乎在所有組織中都存在，在心肌梗死、白血病、腎臟疾病、溶血性貧血等疾病LDH含量增高。當(dāng)細(xì)胞膜受損時，細(xì)胞外液中的LDH滲出，導(dǎo)致LDH含量增多，因此，LDH含量可反映細(xì)胞損傷程度〔14〕。本實驗結(jié)果說明H2O2可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。上調(diào)miR-23b后，血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性升高，MDA含量和LDH活性降低，說明上調(diào)miR-23b可緩解H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。

近年來研究證實，miRNA可作為一類信號調(diào)節(jié)物質(zhì)通過調(diào)控靶基因及相關(guān)信號通路參與多種物種的生命過程，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及組織器官的代謝和發(fā)育等過程〔15,16〕。miR-23b定位于人9號染色體上，在胰腺癌、肝癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-23b表達(dá)能夠抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖，促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞〔18〕。在哮喘小鼠的氣道平滑肌組織中miR-23b表達(dá)量比正常小鼠低，氣道平滑肌細(xì)胞過度增殖，凋亡減少與miR-23b的表達(dá)下降有關(guān)〔19〕。由激素誘導(dǎo)的骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可導(dǎo)致miR-23b表達(dá)發(fā)生明顯的變化，miR-23b可調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡及血管形成，最終影響激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死的病理發(fā)展過程〔20〕。目前研究顯示，Cleaved Caspase-3和Bax是介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志性指標(biāo)，Caspase的活化可引起細(xì)胞內(nèi)DNA內(nèi)切酶活性增加對DNA進(jìn)行剪切，引起細(xì)胞凋亡。Bax的表達(dá)升高可引起B(yǎng)ax/Bcl-2比例上升，引起細(xì)胞凋亡〔21,22〕。本實驗結(jié)果說明miR-23b通過影響凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá)來調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過程。

在前列腺癌細(xì)胞中，miR-23b能夠調(diào)控第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白(PTEN)的表達(dá)，影響磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路中關(guān)鍵信號因子的表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖〔23〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞在血流剪切力下觀察細(xì)胞的生物學(xué)特性實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-23b與MAPK信號通路之間存在回饋調(diào)節(jié)作用〔24,25〕。本實驗結(jié)果說明miR-23b可減少細(xì)胞損傷，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。miR-23b的表達(dá)上調(diào)，與MAPK信號通路相關(guān)蛋白p38-MAPK和p-p38表達(dá)降低，提示miR-23b可抑制MAPK信號通路的激活。加入MAPK信號通路激活劑，可增加上調(diào)miR-23b表達(dá)抑制H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。以上結(jié)果說明miR-23b可通過抑制MAPK信號通路的激活抑制細(xì)胞損傷和凋亡，對H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

miR-23b參與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和損傷保護(hù)的過程，其作用機(jī)制與MAPK信號通路的激活有關(guān)，在血管內(nèi)皮損傷引起的心血管疾病發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，為心血管疾病預(yù)防和治療提供新的切入點(diǎn)。