吳朔明 吳多光 潘引鵬 董淑敏 邵仲凡

(1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港市第一人民醫(yī)院胸外科，江蘇 連云港 222002；2中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院胸外科)

流行病學(xué)資料顯示〔1,2〕，我國約有0.9億食管癌高發(fā)居民，無癥狀癌前病變及癌癥患者比例高達21.88%，但5年生存率僅10%左右。盡管近年來食管鱗癌的手術(shù)切除率明顯提高，相關(guān)并發(fā)癥也顯著下降，但總體治療效果仍不理想〔3〕。因此，進一步研究相關(guān)基因在食管癌發(fā)病機制中的作用具有重要臨床意義。乙醛脫氫酶(ALDH)1是細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化的解毒酶，已被證實可作為乳腺癌、頭頸部鱗癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、眼癌、結(jié)直腸癌干細(xì)胞的通用標(biāo)記物〔4〕。研究表明Numb作為一種在腫瘤干細(xì)胞不對稱分裂過程中起關(guān)鍵作用的膜相關(guān)蛋白，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔5〕。本文旨在探討ALDH1和Numb在食管鱗癌中的表達。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2010～2013年在連云港市第一人民醫(yī)院胸外科由同一術(shù)者手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為食管鱗癌的患者120例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次治療，可行手術(shù)切除；②術(shù)前未進行放療和化療；③有完整的病歷資料，術(shù)后隨訪至死亡或5年以上；④未合并其他腫瘤。⑤年齡≥55歲。男80 例，女40例，年齡 56～82〔平均(65.32±2.36)〕歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性60例。組織分化程度：低分化30例，中分化48 例，高分化42例。 TNM 分期：Ⅳ期18 例，Ⅲ期 36 例，Ⅱ期60例，Ⅰ期 6 例。

1.2ALDH1 mRNA和Numb mRNA檢測方法 ①新鮮食管鱗癌及癌旁正常組織加入液氮中磨碎，每50～100 mg組織加入1 ml TRIzol；②加入0.2 ml氯仿，蓋緊離心管管蓋，上下顛倒混勻60 s(請勿渦漩激烈振蕩)，室溫靜置3 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，置于冰上；③溶液分為3層，RNA溶解在水相中，小心吸取500 μl水相至另一個新的RNase free EP管中；④加入500 μl異丙醇，-20°放置1 h，4℃離心10 min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清；⑤加入1 ml 75%乙醇，用手輕輕顛倒，7 500 r/min離心5 min，棄上清；⑥重復(fù)步驟⑤1次；⑦超凈工作臺上吹干樣品10 min，加入50 μl Rnase Free水溶解沉淀。將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10 000 r/min離心1 min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65℃條件下熱變性5 min后立即置于冰上冷卻2 min。反應(yīng)結(jié)束后，用滅菌去離子水將cDNA稀釋5倍，-20℃保存。引物序列如表1所示。采用ABI7500熒光定量PCR儀進行RT-PCR反應(yīng)，體系為20 μl，反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 34 s(采集熒光信號)，72℃ 30 s。每個cDNA標(biāo)本進行3次PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)以均數(shù)表示，最終結(jié)果按公式2-△△Ct計算。

1.3Western印跡法檢測ALDH1和Numb蛋白表達 新鮮食管鱗癌組織經(jīng)消化、離心收集細(xì)胞，加入RIPA〔50 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，150 mmol/L NaCl，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)〕重懸細(xì)胞，超聲破碎、12 000 r/min，4℃離心10 min，獲得樣本。每個樣本取50 μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，孵育一抗，4℃過夜。洗膜、孵育二抗，37℃ 1 h。電化學(xué)發(fā)光顯影后掃描，蛋白相對表達量經(jīng)內(nèi)參校正后經(jīng)Quanity-One軟件分析。

表1 ALDH1和Numb行RT-PCR的引物序列

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌組織和癌旁組織ALDH1及Numb的表達 ALDH1 mRNA在食管鱗癌組織中相對表達量(11.07±1.18)顯著高于癌旁組織(7.13±2.05，P<0.05)；而食管鱗癌組織中Numb mRNA的相對表達量(2.02±0.02)顯著低于癌旁組織(5.87±0.47，P<0.05)。ALDH1蛋白在食管鱗癌組織中表達量(1.44±0.34)顯著高于癌旁組織(0.98±0.25)(P<0.05)；而食管鱗癌組織中Numb蛋白含量(1.94±0.28)顯著低于癌旁組織(5.16±0.38，P<0.05)。

2.2食管鱗癌組織ALDH1和Numb蛋白表達與不同臨床特征的關(guān)系 ALDH1蛋白和Numb蛋白表達與轉(zhuǎn)移情況、浸潤深度、最大直徑、分化程度及Ki67指數(shù)密切相關(guān)。見表2。

表2 食管鱗癌組織細(xì)胞中ALDH1、Numb蛋白表達與不同臨床特征的關(guān)系

2.3食管鱗癌組織ALDH1蛋白和Numb蛋白表達關(guān)系 ALDH1蛋白和Numb蛋白表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.46，P=0.0349)

3 討 論

即使具有相關(guān)臨床病理因素的食管癌個體，其生存情況也相差較大。而腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)過程，也是影響療效及預(yù)后的主要因素。ALDH1蛋白表達于細(xì)胞質(zhì)中，基因定位于人類9號染色體上，約5.3×104bp。研究表明〔6〕，ALDH1包含13個外顯子，可編碼501個氨基酸殘基，分子由2個亞基組成，1個位于酶的活性中心，另1個起穩(wěn)定4級結(jié)構(gòu)的作用，在輔酶Ⅰ存在的條件下，可催化包括乙醇在內(nèi)的某些一級或二級醇、醛和酮的脫氫反應(yīng)，催化正丁醛、肉桂醛、苯甲醛脫氫反應(yīng)速度比乙醛大，脫下的氫由NAD 接受，使之成為還原型輔酶Ⅰ；在人體正常組織和腫瘤組織中均有表達，主要通過參與氧化視黃醇為視黃酸參與基因的表達和組織分化。而自Ginestier等〔7〕發(fā)現(xiàn)ALDH1是乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物以來，越來越多的研究證實它在乳腺癌、頭頸部鱗癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、眼癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤干細(xì)胞中均有不同程度的表達〔4〕。而腫瘤干細(xì)胞對放化療不敏感，ALDH1表達陽性的患者體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞較多，故易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差。比如，鞏佃霞等〔8〕采用免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織中ALDH1的表達，發(fā)現(xiàn)它與腫瘤大小、分化程度、局部浸潤及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，可作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。覃宇奇等〔9〕在鼻咽癌組織中也發(fā)現(xiàn)ALDH1呈高陽性表達。由此可見，ALDH1可以作為多種腫瘤預(yù)后判斷的指標(biāo)。有研究指出〔10〕，ALDH1可能通過作用于Notch信號通路而發(fā)揮上述生物學(xué)效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，Numb對Notch信號通路的下調(diào)和拮抗作用在腫瘤發(fā)生過程中也起著重要的作用〔11〕。而Numb是一種高度保守的膜相關(guān)蛋白，廣泛存在于果蠅到哺乳動物的各級生物體中。研究表明，Numb的不對稱分布決定了子代細(xì)胞不同的分化方向，因此被稱為細(xì)胞命運決定因子。據(jù)研究，Numb在人類乳腺癌、肝癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用〔12〕；而宮頸鱗癌患者中Numb蛋白的表達量卻顯著升高，發(fā)揮致癌基因的作用〔13〕。本研究證實ALDH1在食管癌的生物學(xué)過程中發(fā)揮致癌作用，Numb基因發(fā)揮抑癌的作用，且可能均通過Notch信號通路而發(fā)揮上述效應(yīng)。ALDH1和Numb基因是否存在交互作用及機制尚需進一步研究。