王毅鋒 宋文廣

(唐山工人醫(yī)院 1婦科，河北 唐山 063000；2放療科)

子宮內膜癌治療方法多樣〔1，2〕，多數(shù)早期患者經(jīng)過手術治療及放化療效果較好，但仍有部分患者出現(xiàn)復發(fā)，一旦復發(fā)或者發(fā)生遠處轉移則傳統(tǒng)的治療方法效果欠佳，預后比較差。子宮內膜癌預后不良的主要原因為初診時患者已出現(xiàn)轉移或者初次治療后復發(fā)，因此探討能夠提示子宮內膜癌復發(fā)及侵襲轉移的生物學指標具有重要意義。轉移相關基因(MTA)1是和腫瘤發(fā)生、侵襲、轉移關系密切的基因〔3〕，在多種惡性腫瘤中MTA1水平升高，且和腫瘤的侵襲轉移有關〔4，5〕。本文研究MTA1在子宮內膜癌中的表達情況及其對子宮內膜癌細胞侵襲轉移的影響。

1 資料與方法

1.1資料 選擇唐山工人醫(yī)院2014年1月至2016年12月臨床資料完整、手術切除治療的子宮內膜癌患者的子宮內膜癌組織標本75例作為子宮內膜癌組，同期因子宮肌瘤行子宮切除的患者的正常子宮內膜組織標本75例作為對照組。子宮內膜癌患者年齡(63.24±3.23)歲，首次進行手術治療，術前未進行放射治療、化學治療及激素治療，均為子宮內膜樣腺癌患者，其中子宮內膜腺癌Ⅰ期35例，Ⅱ期27例，Ⅲ期13例；組織學分級1級28例，2級22例，3級25例。對照組患者子宮內膜為增生期內膜42例，分泌期內膜33例。所有患者簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批。

細胞和主要試劑：人子宮內膜癌細胞系HEC-1-C(中國上海栩冉生物科技有限公司)，siRNA MTA1質粒及陰性對照質粒(廣州瑞博生物科技公司)，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，MTA1多克隆抗體、β-actin抗體(美國Abcam公司)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白試劑盒、RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒(美國Sigma公司)，Transwell小室(美國BD公司)等。

1.2實驗方法

1.2.1采用免疫組織化學法測定子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中MTA1蛋白的表達情況 將石蠟切片常規(guī)脫蠟，按照免疫組織化學試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，以MTA1多克隆抗體為一抗，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。細胞核或者細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為MTA1陽性表達，根據(jù)著色強度分為0～3分；根據(jù)陽性細胞數(shù)分為0～3分，細胞著色強度分數(shù)+陽性細胞數(shù)分數(shù)，0～1分為MTA1陰性，兩者相加≥2分為MTA1陽性。

1.2.2子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中MTA1 mRNA表達情況 采用RT-PCR測定子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中MTA1 mRNA表達情況。提取組織總RNA，以β-actin為內參照，反應條件為95℃ 10 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，72℃ 60 s，共40個循環(huán)。

1.2.3人子宮內膜癌細胞系HEC-1-C細胞分組 人子宮內膜癌HEC-1-C細胞分為3組：siRNA MTA1組，人子宮內膜癌HEC-1-C細胞轉染siRNA MTA1序列；陰性對照組，人子宮內膜癌HEC-1-C細胞轉染陰性對照序列；空白對照組，人子宮內膜癌HEC-1-C細胞未進行轉染。

1.2.4轉染后各組人子宮內膜癌HEC-1-C細胞中MTA1蛋白表達測定 將人子宮內膜癌細胞系HEC-1-C細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h后用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)，取生長良好的人子宮內膜癌細胞系HEC-1-C提取細胞總蛋白，以MTA1單克隆抗體為一抗，以β-actin為內參照，采用Western印跡檢測人子宮內膜癌HEC-1-C細胞中MTA1蛋白表達情況。

1.2.5轉染后各組人子宮內膜癌HEC-1-C細胞中MTA1 mRNA表達測定 將人子宮內膜癌HEC-1-C細胞培養(yǎng)48 h后，提取人子宮內膜癌HEC-1-C細胞總RNA，以β-actin mRNA為內參，采用RT-PCR法測定人子宮內膜癌HEC-1-C細胞中MTA1 mRNA表達，反應條件為95℃ 10 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，72℃ 60 s，共40個循環(huán)。

1.2.6轉染后各組人子宮內膜癌HEC-1-C細胞侵襲能力測定 采用Transwell實驗測定人子宮內膜癌HEC-1-C細胞的侵襲能力。

1.2.7轉染后各組人子宮內膜癌HEC-1-C細胞遷移能力測定 采用劃痕損傷實驗測定人子宮內膜癌HEC-1-C細胞的遷移能力。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件，率的比較采用χ2檢驗，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1子宮內膜癌組及對照組MTA1蛋白陽性表達情況 子宮內膜癌組MTA1蛋白陽性率〔62例(82.7%〕顯著高于對照組〔20例(26.7%)，χ2=147.453,P<0.05〕。

2.2子宮內膜癌組織中MTA1 mRNA表達情況 子宮內膜癌組MTA1 mRNA表達量(0.72±0.06)明顯高于對照組(0.34±0.04，t=12.153，P<0.05)。

2.3病毒轉染后各組HEC-1-C細胞中MTA1蛋白和MTA1 mRNA表達情況 siRNA MTA1組HEC-1-C細胞中MTA1蛋白和MTA1 mRNA表達均低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 各組HEC-1-C細胞中MTA1蛋白和MTA1 mRNA表達情況

與siRNA MTA1組比較:1)P<0.05

圖1 各組細胞中MTA1蛋白的表達

2.4病毒轉染后各組HEC-1-C細胞的體外侵襲情況 siRNA MTA1組HEC-1-C細胞的穿膜細胞比例〔(23.14±2.76)%〕顯著低于陰性對照組〔(57.46±3.42)%〕和空白對照組〔(59.03±3.25)%,F=231.546,P<0.05〕。見圖2。

圖2 三組細胞的Transwell體外侵襲實驗結果(×200)

2.5病毒轉染后各組HEC-1-C細胞的體外遷移情況 siRNA MTA1組HEC-1-C細胞遷移率〔(21.34±0.31)%〕低于陰性對照組〔(63.24±0.45)%〕和空白對照組〔(64.45±0.38)%,F=165.375,P<0.05〕。見圖3。

圖3 三組細胞的劃痕損傷實驗結果(×200)

3 討 論

腫瘤的侵襲轉移是多因素、多步驟相互作用的動態(tài)過程，腫瘤細胞浸潤鄰近組織進入血液循環(huán)或者淋巴循環(huán)，隨著血液循環(huán)進入遠處毛細血管，通過毛細血管滲透到軟組織形成微小轉移病灶，微小轉移病灶繼續(xù)生長為肉眼可見的轉移腫瘤病灶。此腫瘤轉移過程受信號轉導系統(tǒng)的調節(jié)，并有多個基因發(fā)生數(shù)量和質量的變化，包括癌基因和腫瘤轉移相關基因的激活、抑癌基因和腫瘤轉移抑制相關基因的失活，這些基因的改變可引起癌細胞生物學行為的改變，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移。人MTA1基因相對分子量為82 kD，其編碼的蛋白質位于組蛋白去乙酰化酶和核染色體重構復合物中，通過乙?；慕M蛋白影響基因的表達，MTA1含有一個BAH區(qū)域，此結構在DNA的甲基化及DNA的復制、轉錄調節(jié)中發(fā)揮重要作用〔6，7〕。大量研究發(fā)現(xiàn)MTA1和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，MTA1在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，其高表達和惡性腫瘤的侵襲轉移有關〔8，9〕。本文結果發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌組織中MTA1呈高表達水平，MTA1可能也參與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展。

MTA1含有一個富含脯氨酸的支鏈，MTA1通過該支鏈參與細胞信號的轉導及細胞凋亡等相關基因蛋白表達的調控，從而參與腫瘤細胞的侵襲轉移。MTA1能夠一直抑癌基因P53的表達，從而對惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響。MTA1能夠穩(wěn)定HIF-1-α，并增強其活性，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移。MTA1能夠增加組蛋白的去乙酰化，阻止雌激素受體作用元件激活的基因轉錄，從而增強惡性腫瘤的侵襲轉移能力〔10，11〕。大量研究發(fā)現(xiàn)MTA1和惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移有關，參與多種惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移〔12，13〕。RNA干擾技術是通過短雙鏈RNA降解具有同源序列的mRNA從而導致基因沉默的現(xiàn)象，siRNA是短雙鏈RNA，特殊設計的siRNA可以特異性沉默目的基因。隨著RNA干擾技術的不斷成熟，RNA干擾技術已經(jīng)成為基因表達調控、基因藥物研發(fā)、傳導通路及藥物靶點鑒定的有效方法，在腫瘤的基因治療中有望給腫瘤的治療提供更多的治療靶點〔14～16〕。本文采用RNA干擾技術沉默子宮內膜癌HEC-1-C細胞中的MTA1基因，結果發(fā)現(xiàn)：沉默子宮內膜癌HEC-1-C細胞中的MTA1基因后，子宮內膜癌HEC-1-C細胞中的MTA1蛋白和mRNA的表達下降，子宮內膜癌HEC-1-C細胞的侵襲和遷移能力也下降。可見，RNA干擾技術能夠沉默子宮內膜癌HEC-1-C細胞中的MTA1基因表達，子宮內膜癌組織中MTA1基因的高表達和子宮內膜癌的侵襲和轉移有關，能夠促進子宮內膜癌的侵襲和轉移。