胡瑞婷 覃冬華 胡瑞光 馮曉敏

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院神經(jīng)內二科，廣西 南寧 530001)

缺血性腦卒中缺血性腦卒中發(fā)病過程中伴隨著多個基因的改變，這些基因的表達上調或下調對疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸起到重要的作用〔1，2〕。本文通過分析缺血性腦卒中發(fā)病時發(fā)生的基因改變，旨在分析該病的外周血基因表達譜，初步篩選出急性缺血性腦卒中發(fā)病過程中的起重要調控作用的基因。

1 資料與方法

1.1標本數(shù)據(jù) 從美國國家生物技術信息中心的Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以“ischemic stroke”為檢索詞，檢索有關缺血性腦卒中的基因表達譜微列陣數(shù)據(jù)。納入排除標準：①數(shù)據(jù)集必須是全基因組的表達mRNA芯片數(shù)據(jù)；②數(shù)據(jù)是關于缺血性腦卒中患者和正常人外周血標本的結果；③每個數(shù)據(jù)集的標本量必須大于20個(例)。

1.2差異表達基因篩選 采用R3.2.0軟件和Bioconductor中的limma軟件包對下載的基因表達譜數(shù)據(jù)進行分析，先對數(shù)據(jù)進行標準化和Log2轉化，在采用t檢驗篩選差異表達基因。差異基因的選擇需同時滿足以下條件：①組間基因表達值比較P<0.05；②組間差異表達倍數(shù)(fold change)>1.0倍。

1.3基因功能注釋和信號通路分析 將獲得的差異表達基因輸入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)在線工具進行基因功能分析，包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組成(CC)三部分，再利用(DAVID)中(KEGG)工具對這些基因進行信號通路分析，以P<0.05為有顯著意義的基因功能或信號通路。

1.4蛋白-蛋白互作分析(PPI) 將差異表達基因輸入在線分析工具STRING10.0 (http：//www.string-db.org/) 對腦卒中發(fā)病相關基因表達產(chǎn)物構建PPI網(wǎng)絡，再使用STRING得到的PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)輸入Cytoscape軟件進行可視化分析，再使用MOCDE插件分析出PPI網(wǎng)絡中的子網(wǎng)絡，根據(jù)每個基因在的網(wǎng)絡中的關聯(lián)系數(shù)顯示節(jié)點顏色深淺。

2 結 果

2.1標本信息 根據(jù)納入排除標準，檢索到2個GEO數(shù)據(jù)(GSE22255〔3〕和GSE16561〔4〕)共99個樣本，分別納入55個缺血性腦卒中患者外周血標本和44個健康對照人群外周血標本，患者均為發(fā)病時采集外周血標本。其中男47例，女52例，分別采用Affymetrix和Illumina芯片平臺檢測。兩個標本的基本資料見表1。

2.2差異表達基因篩選 以P<0.05，差異倍數(shù)>1倍為條件進行篩選，共得到61個差異表達基因，分別為：GSE22255得到40個差異表達基因，其中表達上調38個，下調2個；GSE16561得到21個差異表達基因，其中表達上調20個，下調1個；兩個樣本數(shù)據(jù)中差異表達前10個基因均為上調基因。見表2。

表1 納入標本的基本資料

表2 差異表達倍數(shù)前10個基因

2.3PPI 使用STRING10.0軟件將61個差異表達基因進行PPI，共得到44個節(jié)點及95條相互關系連接線，如圖1所示，人類白細胞抗原(HLA)-DRB1、肽?；彼崦搧啺访?PADI4)、IgG-Fc片段低親和力受體(FCGR)3B、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞因子信號抑制物(SOCS)3這5個基因與其他基因的關聯(lián)系數(shù)最高；根據(jù)MOCDE的計算結果得到一個子網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡有10個基因，其中TNF是該子網(wǎng)絡的核心基因。

2.4基因功能注釋和信號通路分析 對兩個樣本的61個差異表達基因進行基因功能注釋和信號通路分析，結果GO基因功能注釋顯示這些差異表達基因主要參與炎癥反應、免疫反應、中性粒細胞趨化生物過程；主要分子功能為化學因子活性、蛋白結合、細胞因子活性等；KEGG通路顯示這些差異表達基因主要參與類風濕性關節(jié)炎通路、腫瘤壞死因子通路、Toll樣受體通路。見表3。

A：差異表達基因整體互作網(wǎng)絡圖，顏色越紅表示基因表達上調倍數(shù)越高，綠色表示表達下調；B：差異表達基因整體互作網(wǎng)絡中的子網(wǎng)絡圖圖1 缺血性腦卒中差異表達基因PPI圖

表3 基因功能和信號通路分析

3 討 論

缺血性腦卒中是由于局部血管梗死，相應供血區(qū)域血流灌注不足，從而導致肢體運動、感覺障礙等相關臨床癥狀的腦血管疾病〔5〕。調查顯示，43%～65%的腦卒中患者屬于缺血性腦卒中，是腦卒中的主要類型〔6〕。缺血性腦卒中與其他缺血性疾病類似，其發(fā)病過程是一個多基因、多步驟、多途徑、多階段相互作用和相互影響的復雜過程，這是導致該病治療困難，致殘率高、復發(fā)率高的重要原因〔7〕。因此，從分子水平揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機制，成為該病治療的研究熱點〔8〕。生物基因芯片技術具有快速、高效、大規(guī)模、平行化地檢測基因表達的優(yōu)勢，采用生物信息學方法分析疾病發(fā)生過程的基因表達變化，可以為我們更好地理解缺血性腦卒中的發(fā)病機制提供有益的線索〔4〕。

本文發(fā)現(xiàn)61個基因有較顯著的差異表達，提示這些基因可能參與了缺血性腦卒中的發(fā)病過程。本文發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1、PADI4、FCGR3B、TNF、SOCS3的相互作用在缺血性腦卒中發(fā)病中與其他差異表達基因關聯(lián)度最高，提示這個基因有可能在缺血性腦卒中的病變過程中其主要作用。在這5個基因中，HLA-DRB1、TNF、FCGR3B、 SOCS3與腦卒中的作用得到了驗證，如陳維等〔9〕報道HLA-DRB1單倍型與缺血性腦卒中的發(fā)生呈易感關聯(lián)，TNF和SOCS3在腦卒中發(fā)病中的作用已有較多的報道〔10，11〕，而尚未檢索到PADI4在腦卒中的作用報道，而且FCGR3B的報道也較少〔12〕，提示可以對PADI4和FCGR3B基因進行后續(xù)的基礎和臨床驗證研究。

目前國內尚未有文獻報道缺血性腦卒中患者外周血發(fā)病過程中差異表達基因的研究結果，本文首次報道了該結果。然而本文也存在不足之處，首先是研究的標本量較小，這與目前發(fā)表的數(shù)據(jù)有關，如果有更多的基因表達譜數(shù)據(jù)發(fā)表，則可以將其納入進一步分析。其次是本文只分析了缺血性腦卒中患者的結果，沒有對不同類型，如急性或慢性缺血性腦卒中患者，血管性或其他原因引起的腦缺血類型進行亞組分析，這些都是今后進一步的研究方向。

總之，缺血性腦卒中患者外周血發(fā)病過程有多個基因表達發(fā)生顯著改變，篩選出來的HLA-DRB1、PADI4、FCGR3B、TNF、SOCS3等基因有望成為今后對缺血性腦卒中干預新的研究靶點。對這些基因在缺血性腦卒中的具體作機制還未明確，還需要進行更深入的實驗研究。