董玲鳳，張靜雯，黃建洲，池霖生，陳棪焜，馬文敏

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山市婦幼保健院輔助生殖技術(shù)中心，佛山 528000)

胚胎玻璃化冷凍解凍技術(shù)由于其快速、簡(jiǎn)便、損傷小、復(fù)蘇存活率高等優(yōu)勢(shì)迅速應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域中[1]。多項(xiàng)研究表明凍融胚胎移植(FET)成功率主要與胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備、子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性等主要因素有關(guān)[2-4]。如何合理把握胚胎“種植窗”提高解凍周期臨床妊娠率成為臨床醫(yī)生和胚胎學(xué)家關(guān)注的重點(diǎn)[5-8]。本研究回顧性分析激素替代周期(HRT)中胚胎解凍后不同的體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)移植周期臨床結(jié)局的影響。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象及分組：收集本生殖中心2016年1月1日至2017年12月31日進(jìn)行的270個(gè)FET周期為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡≤35歲，首次解凍移植周期，內(nèi)膜準(zhǔn)備采用HRT方案，移植兩枚解凍后卵裂球100%存活的優(yōu)質(zhì)卵裂期(D3)胚胎。排除胚胎反復(fù)凍融的移植周期。

所有周期按照解凍后胚胎在體外培養(yǎng)時(shí)間的不同分為正常解凍組(168個(gè)周期)和提前解凍組(102個(gè)周期)。正常解凍組：第3天(D3)移植，移植當(dāng)天早上8～9點(diǎn)解凍，解凍后D3胚胎體外培養(yǎng)2～3 h后移植，移植前0.5 h轉(zhuǎn)入移植液EmbryoGlue(Vtriolife，瑞典)中平衡；提前解凍組：D3胚胎于移植前1 d(D2)下午16～17點(diǎn)左右解凍，解凍后D3胚胎體外培養(yǎng)17～18 h，次日8～9點(diǎn)移植(D3)，移植前0.5 h轉(zhuǎn)入EmbryoGlue液中平衡。

2.主要儀器與試劑：胚胎培養(yǎng)箱(LABOTECT，德國(guó))；倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)；體視顯微鏡(NIKON，日本)；IVF工作站(K-SYSTEMS，丹麥)；玻璃化冷凍套裝[含平衡液(ES)、玻化液(VS)]、玻璃化解凍套裝(含WS1、WS2、WS3、WS4四種液體)(OrigioMEDICULT，丹麥)；半封閉式載桿(cryotop，加藤，日本)；胚胎培養(yǎng)液IVF-PLUS、G1-PLUS、G2-PLUS、培養(yǎng)油及移植液EmbryoGlue(Vtriolife，瑞典)。

3.研究方法：促排方案的選擇、胚胎冷凍及解凍、胚胎移植等按照本中心常規(guī)程序進(jìn)行。胚胎玻璃化冷凍方法：冷凍試劑ES、VS室溫平衡0.5 h后，將D3胚胎在200 μl的ES中平衡6～7 min，待其形態(tài)恢復(fù)后，在100 μl的VS中沖洗數(shù)次，胚胎裝入載桿，迅速投入液氮，胚胎在VS中的時(shí)間到投入液氮整個(gè)過程不超過1 min。胚胎玻璃化解凍方法：解凍試劑包括WS1、WS2、WS3及WS4四種液體，提前0.5 h取出1 ml WS1倒入雙凹皿中并置于無CO2、37℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫，其余3種液體分別置于室溫下四孔板中復(fù)溫。解凍時(shí)，快速將含胚胎載桿段浸入37℃的WS1中，輕晃使胚胎落下，37℃放置1 min，隨后在WS2、WS3、WS4-1、WS4-2中分別平衡3 min，最后將胚胎轉(zhuǎn)入6%CO2過夜平衡的G2培養(yǎng)液中，記錄卵裂球損傷情況，進(jìn)行胚胎評(píng)分后放置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中。移植前0.5 h將G2內(nèi)的解凍胚胎轉(zhuǎn)移至胚胎膠中。

胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：本中心主要根據(jù)卵裂球數(shù)目、均一性及碎片率進(jìn)行評(píng)分。記錄卵裂球個(gè)數(shù)；均一性分3級(jí)(1級(jí)：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則；2級(jí)：大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則；3級(jí)：大小明顯不均，可有明顯的形態(tài)不規(guī)則)；碎片分4級(jí)(1級(jí)：無碎片或碎片數(shù)量<5%；2級(jí)：碎片數(shù)量<20%；3級(jí)：碎片數(shù)量為20%～50%；4級(jí)：碎片數(shù)量>50%)。D3優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：D3胚胎細(xì)胞數(shù)為7～9個(gè)，細(xì)胞均一性為1～2級(jí)，碎片1～2級(jí)。

HRT及胚胎移植：對(duì)于內(nèi)膜薄、反復(fù)排卵周期冷凍移植失敗、不明原因不孕癥、排卵障礙誘發(fā)排卵失敗、自然周期異常出血、自然周期排卵異常等患者采用HRT方案。具體流程：子宮內(nèi)膜厚度達(dá)到8 mm或以上時(shí)進(jìn)行子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，72 h后移植。胚胎移植后第14天查尿HCG/β-HCG，確定是否妊娠。如陽(yáng)性繼續(xù)用HCG或黃體酮至妊娠10～12周左右，胚胎移植28～35 d后行B超檢查，如妊娠囊中可探查到胎芽及搏動(dòng)的胎心則為臨床妊娠。12周前的胚胎停育為早期流產(chǎn)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)定性資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.兩組一般資料比較：正常解凍組和提前解凍組的女方年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、子宮內(nèi)膜厚度等基本資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.兩組患者臨床結(jié)局比較：提前解凍組的臨床妊娠率(58.82%)略高于正常解凍組(58.33%)，但無顯著性差異(P>0.05)；提前解凍組的胚胎種植率(38.73%)略低于正常解凍組(39.58%)，亦無顯著性差異(P>0.05)；提前解凍組的流產(chǎn)率(11.67%)有高于正常解凍組(9.18%)的趨勢(shì)，但兩者無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般資料比較(-±s)

表2 兩組患者臨床結(jié)局比較(%)

三、討論

解凍后卵裂期胚胎延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間能否提高解凍移植周期的臨床妊娠率，一直存在爭(zhēng)議。影響解凍卵裂期胚胎臨床妊娠率的原因很多，如女方年齡、不孕年限、子宮內(nèi)膜厚度、胚胎質(zhì)量、內(nèi)膜準(zhǔn)備方式、移植胚胎數(shù)及解凍后卵裂球損傷等[9-13]。在本研究中，限制研究對(duì)象為首次解凍移植周期、內(nèi)膜準(zhǔn)備為HRT方案、女方年齡≤35歲的年輕不孕患者，排除了年齡、內(nèi)膜準(zhǔn)備方式、FET重復(fù)失敗周期等的影響因素；只納入移植兩枚解凍后完整存活的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的周期，排除了明顯冷凍損傷的卵裂球?qū)ε咛シN植率及臨床妊娠率等方面的影響，以盡量去除干擾因素，使結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確。

本研究結(jié)果表明對(duì)于≤35周歲、HRT-FET移植2枚完整存活的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的年輕不孕人群，延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間并不能顯著提高其臨床妊娠率，提示胚胎質(zhì)量對(duì)臨床妊娠結(jié)局有重要影響，解凍后卵裂球完好的優(yōu)質(zhì)胚胎可能由于有較好的發(fā)育潛能，在體內(nèi)、外都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，故不同解凍時(shí)間組的臨床結(jié)局無顯著性差異，這一結(jié)果與劉曉音等[14]在研究中提到延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間并不顯著影響玻璃化凍融胚胎發(fā)育潛能的結(jié)論相似。羅金等[15]的研究也認(rèn)為次日移植并不能提高臨床妊娠率和種植率，反而增加了流產(chǎn)率。本研究結(jié)果亦表明延長(zhǎng)解凍胚胎的體外培養(yǎng)時(shí)間可能使早期流產(chǎn)率有增加趨勢(shì)，但目前尚無顯著性差異。之前有研究認(rèn)為胚胎解凍后過夜培養(yǎng)，有卵裂球細(xì)胞生長(zhǎng)的胚胎能夠獲得較高的種植率、妊娠率，生長(zhǎng)為桑葚胚者能夠獲得較好的妊娠結(jié)局[9-13]，說明延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間可能有利用選擇更好發(fā)育潛能的胚胎，提示我們對(duì)于質(zhì)量較差或者細(xì)胞數(shù)較少的冷凍胚胎，可以選擇延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間來進(jìn)一步篩選有較好發(fā)育潛能的胚胎。

綜上所述，對(duì)于擁有凍融優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的年輕患者而言，延長(zhǎng)解凍胚胎的體外培養(yǎng)時(shí)間并不能更加改善其臨床結(jié)局，提示我們?cè)谂R床工作中可靈活安排胚胎的解凍和移植時(shí)間。但由于本研究樣本量較小，研究結(jié)論可能存在一定的局限性，后續(xù)研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量，完善研究設(shè)計(jì)后進(jìn)一步加以探索。