韓貞艷，畢菲菲，郝振凱，于詠蘭，索 勛，劉賢勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193)

雞球蟲(chóng)病是由一種或多種艾美耳球蟲(chóng)寄生于雞腸道不同部位所引起的一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)病[1]。雞球蟲(chóng)在田間廣泛存在，凡有雞的地方就有雞球蟲(chóng)。雞球蟲(chóng)病常見(jiàn)于規(guī)?；纳唐佛B(yǎng)雞場(chǎng)，發(fā)病率可達(dá)50%～70%，死亡率20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%。雞球蟲(chóng)病導(dǎo)致飼料報(bào)酬率低，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

目前控制球蟲(chóng)病的主要方法依靠抗球蟲(chóng)藥物。迄今用于臨床的數(shù)十種抗球蟲(chóng)藥物按其來(lái)源、化學(xué)結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)過(guò)程大致可分化學(xué)合成類藥物、聚醚類離子載體抗生素和草藥制劑等三大類。抗球蟲(chóng)藥物主要通過(guò)影響細(xì)胞膜的功能(離子載體類)、阻礙能量代謝(喹諾酮，尼卡巴嗪等)、影響輔助因子的合成(磺胺類，氨丙啉等)、影響DNA(氟嘌呤類)或蛋白質(zhì)的合成(均三嗪類)等發(fā)揮抗球蟲(chóng)作用[3]。但是隨著抗球蟲(chóng)藥物的廣泛和長(zhǎng)期使用，產(chǎn)生了十分嚴(yán)重的球蟲(chóng)耐藥性問(wèn)題。球蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生，一方面會(huì)導(dǎo)致藥物的防治效果不佳或失敗，藥物的使用年限縮短；另一方面為了能有效控制球蟲(chóng)病的發(fā)生，需加大用藥劑量，從而增加養(yǎng)殖成本，造成藥物殘留，同時(shí)增加對(duì)環(huán)境的污染。因此，球蟲(chóng)耐藥性問(wèn)題不僅是雞球蟲(chóng)病的防治問(wèn)題，更是食品安全和公共衛(wèi)生問(wèn)題。

地克珠利作為聚醚類的三嗪苯乙腈化學(xué)合成藥物，抗球蟲(chóng)效果優(yōu)于作用于第1代裂殖體的聚醚類藥物和其他抗球蟲(chóng)藥，具備高效、低毒、廣譜的抗球蟲(chóng)效力。地克珠利在田間應(yīng)用廣泛應(yīng)用是在1990年，但是1994年就出現(xiàn)了關(guān)于地克珠利抗藥性的報(bào)道[4]。地克珠利耐藥性的出現(xiàn)促使球蟲(chóng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)地克珠利作用的分子機(jī)制展開(kāi)了研究。

1 地克珠利抗雞球蟲(chóng)作用相關(guān)基因或蛋白

地克珠利作用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第2代裂殖子差異基因編碼的同源蛋白主要包括：柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的微線蛋白、表面抗原、肌動(dòng)蛋白解聚因子、熱休克蛋白90、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)的激活蛋白激酶C受體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)(Theileriaannulata)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶等[5]。另外研究者們發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶和絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶也很可能在抵抗地克珠利時(shí)發(fā)揮作用[6-7]。

1.1 乳酸脫氫酶 乳酸脫氫酶(LDH)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間可逆的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生能量，對(duì)于寄生蟲(chóng)的存活至關(guān)重要[5]。有研究結(jié)果表明，來(lái)自不同頂復(fù)門寄生蟲(chóng)的乳酸脫氫酶相對(duì)于其宿主的乳酸脫氫酶具有獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)特性，因此是診斷和藥物篩選的潛在理想靶標(biāo)[8]。有研究顯示，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第2代裂殖子中乳酸脫氫酶的mRNA水平高于未孢子化的卵囊、孢子化卵囊和子孢子這3個(gè)發(fā)育階段中的mRNA水平，乳酸脫氫酶的蛋白表達(dá)水平在第2代裂殖子中也最為突出，由此推測(cè)第2代裂殖子中乳酸脫氫酶的高度表達(dá)可能與其增加的能量需求相關(guān)聯(lián)——因?yàn)槿樗崦摎涿冈谔墙徒庵衅鹬豢苫蛉钡淖饔?，而糖酵解途徑是為?nèi)源發(fā)育階段寄生蟲(chóng)提供能量的必需代謝途徑，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)可依靠此途徑獲取能量維持生存[9]。據(jù)報(bào)道，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶的RNA僅在裂殖體中能觀察到，表明其合成被限制在細(xì)胞內(nèi)階段[10]。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶的蛋白編碼區(qū)長(zhǎng)度為996 bp，編碼331個(gè)氨基酸。有研究顯示，該基因在地克珠利耐藥株與敏感株的差別為在第 305位有1個(gè)氨基酸的差異，敏感株為谷氨酸，而耐藥株為甘氨酸[6]。在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的不同發(fā)育階段，地克珠利敏感株乳酸脫氫酶mRNA的相對(duì)含量都明顯高于耐藥株；與之對(duì)應(yīng)的，在第2代裂殖子階段，地克珠利耐藥株的乳酸脫氫酶蛋白的相對(duì)表達(dá)量比敏感株下降了55.32%。該研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期的藥物誘導(dǎo)使柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶的基因表達(dá)水平發(fā)生了改變。由此推斷，地克珠利抗球蟲(chóng)的作用機(jī)理可能和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶參與的糖酵解途徑有關(guān)。

1.2 蛋白激酶C受體蛋白 蛋白激酶C(PKC)是一種細(xì)胞質(zhì)酶，在未受刺激的細(xì)胞中，蛋白激酶C主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，呈非活性構(gòu)象，一旦有第二信使的存在，蛋白激酶C將成為膜結(jié)合的酶，它能激活細(xì)胞質(zhì)中的酶，參與生化反應(yīng)的調(diào)控，同時(shí)也能作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，參與基因表達(dá)的調(diào)控[11]。蛋白激酶C受體1(RACK1)在原核和真核生物高度保守，參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，作用非常重要，其中在蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，蛋白激酶C受體1能夠與蛋白激酶C結(jié)合，調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性[12]。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白激酶C受體蛋白核苷酸序列全長(zhǎng)1 264 bp，與來(lái)自弓形蟲(chóng)的蛋白激酶C受體蛋白在氨基酸水平有98%的同源性[13]。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白激酶C受體蛋白位于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的第2代裂殖子中的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，表明其可能作為細(xì)胞內(nèi)適配器廣泛的參與細(xì)胞活動(dòng)并促進(jìn)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的侵襲力，是球蟲(chóng)無(wú)性生殖階段第2代裂殖子階段是必不可少的一種蛋白。研究者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白激酶C受體蛋白在第2代裂殖子階段發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白激酶C受體蛋白 mRNA的表達(dá)水平下降了81.3%[13]。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白激酶C受體蛋白mRNA表達(dá)水平的下調(diào)可能會(huì)引起下游的蛋白質(zhì)功能發(fā)生障礙，抑制與入侵相關(guān)的分泌蛋白表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白激酶C受體蛋白mRNA表達(dá)水平的下調(diào)表明，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蛋白激酶C受體蛋白可能存在地克珠利作用的靶點(diǎn)。

1.3 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)主要參與細(xì)胞的糖酵解途徑。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，甘油醛-3-磷酸脫氫酶不僅是一種糖酵解酶，還是一種多功能蛋白，參與許多亞細(xì)胞活動(dòng)，主要有催化微管聚合，參與蛋白磷酸化修飾、膜融合和膜轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)以及參與DNA修復(fù)損傷作為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等，在其他多細(xì)胞生物上，甘油醛-3-磷酸脫氫酶的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。

地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第2代裂殖子甘油醛-3-磷酸脫氫酶mRNA表達(dá)水平顯著提高，第2代裂殖子細(xì)胞核中出現(xiàn)了大量的甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白，并且柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第2代裂殖子出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)明顯減少、發(fā)生異染色質(zhì)化，凝集成大的黑色團(tuán)塊、與核膜分離并發(fā)生趨邊化，線粒體脊模糊、斷裂，胞質(zhì)中出現(xiàn)了大量的空泡等細(xì)胞凋亡的典型癥狀[15]。地克珠利引起的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的細(xì)胞凋亡可能與第2代裂殖子甘油醛-3-磷酸脫氫酶的累積有很大關(guān)系，地克珠利通過(guò)作用于甘油醛-3-磷酸脫氫酶發(fā)揮抗球蟲(chóng)作用。

1.4 熱休克蛋白90 熱休克蛋白90(Hsp90)在應(yīng)激耐受性，新合成的蛋白質(zhì)折疊和各種生物的生長(zhǎng)中起著重要作用[16]。在弓形蟲(chóng)中，熱休克蛋白90對(duì)入侵宿主細(xì)胞和在宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)是必需的[17]；在惡性瘧原蟲(chóng)中，通過(guò)使用藥物格爾登霉素(GA)進(jìn)行的抑制試驗(yàn)證實(shí)了熱休克蛋白90參與惡性瘧原蟲(chóng)在人類紅細(xì)胞中的生長(zhǎng)[18]；有研究者用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)熱休克蛋白90產(chǎn)生的抗體預(yù)孵育子孢子，然后感染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子孢子入侵率下降了75%，表明熱休克蛋白90能夠影響柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的侵襲能力[16]。

Shen[19]等研究了地克珠利對(duì)球蟲(chóng)第2代裂殖子熱休克蛋白90的作用，試驗(yàn)中兩組雞分別接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊，試驗(yàn)組雞從接種后96-120 h飼喂含1 mg/kg地克珠利飼料，對(duì)照組一直飼喂不含地克珠利飼料，收集接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)120 h后盲腸中的第2代裂殖子，提取總RNA，并表達(dá)純化出熱休克蛋白90蛋白，然后利用qPCR的方法檢測(cè)熱休克蛋白90 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地克珠利治療組熱休克蛋白90 mRNA的表達(dá)水平比對(duì)照組下降了29.7%，蛋白質(zhì)印跡分析發(fā)現(xiàn)地克珠利治療組的第2代裂殖子的熱休克蛋白90蛋白水平與對(duì)照組相比降低了50.0%。這些結(jié)果表明，地克珠利使第2代裂殖子中的熱休克蛋白90的表達(dá)水平下調(diào)，據(jù)此推測(cè)熱休克蛋白90是抗球蟲(chóng)感染中一個(gè)潛在的地克珠利藥物靶標(biāo)。

1.5 絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶 蛋白磷酸酶是能夠催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同構(gòu)成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開(kāi)關(guān)系統(tǒng)[20]。可逆蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化在細(xì)胞生命的大多數(shù)方面起著重要作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，分化，衰老和凋亡[21]。人類中有3種主要的蛋白磷酸酶，分別是酪氨酸磷酸酶(PTPase)、絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(PPase)和雙重特異性磷酸酶(DSPase)[22]。根據(jù)去磷酸化的氨基酸殘基的不同，蛋白磷酸酶分成蛋白酪氨酸磷酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶(PP5，PPP5C)是哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶基因家族的成員之一，已經(jīng)證實(shí)絲氨酸/蘇氨酸5型蛋白磷酸酶包含調(diào)節(jié)四肽多肽重復(fù)(TPR)結(jié)構(gòu)域，并且在許多細(xì)胞應(yīng)答中的信號(hào)通路中起作用[20]。

Zhou等[7]研究地克珠利對(duì)絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的作用時(shí)，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地克珠利處理組柔嫩艾美耳球蟲(chóng)絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的mRNA表達(dá)水平比未加地克珠利的對(duì)照組下降了51.4%。地克珠利作用后還引起柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第2代裂殖子的凋亡，其機(jī)制可能與絲氨酸/蘇氨酸5型蛋白磷酸酶的下調(diào)表達(dá)有很大關(guān)系。球蟲(chóng)產(chǎn)生抗地克珠利藥物的靶點(diǎn)很有可能位于絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶這個(gè)基因上。

1.6 微線蛋白 微線是位于所有頂復(fù)門寄生蟲(chóng)入侵階段前端的分泌細(xì)胞器，宿主細(xì)胞刺激后，微線蛋白在寄生蟲(chóng)頂端分泌[23]。研究表明，一些微線蛋白質(zhì)作為專門的粘附素起作用，在寄生蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)和附著宿主細(xì)胞中有重要作用[24]。

地克珠利作用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)中的5種重要的與球蟲(chóng)侵襲相關(guān)的微線蛋白的mRNA表達(dá)均發(fā)生了下調(diào)，其中微線基因1下調(diào)65.63%，微線基因2下調(diào)64.12%，微線基因3下調(diào)56.82%，微線基因4下調(diào)73.48%，微線基因5下調(diào)78.17%[25]。地克珠利作用球蟲(chóng)后，影響了球蟲(chóng)第2代裂殖時(shí)期微線基因的表達(dá)水平，推測(cè)地克珠利通過(guò)作用與入侵相關(guān)的微線基因發(fā)揮抗球蟲(chóng)作用，微線基因可能是地克珠利作用的靶基因。

2 展望

當(dāng)前對(duì)地克珠利抗雞球蟲(chóng)的分子作用機(jī)理研究著重于研究與地克珠利作用可能相關(guān)的基因和蛋白。本文所述的地克珠利抗雞球蟲(chóng)作用相關(guān)基因和蛋白是球蟲(chóng)入侵、代謝及信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子。地克珠利作用后，這些基因或蛋白的表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化，地克珠利作用的位點(diǎn)很可能位于其中某個(gè)基因或蛋白上，但是有關(guān)地克珠利確切的調(diào)控機(jī)理及其相互之間的作用關(guān)系還需要進(jìn)一步深入的研究。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，更多新技術(shù)在抗球蟲(chóng)藥物領(lǐng)域得到運(yùn)用，有望真正揭示球蟲(chóng)抗地克珠利的分子機(jī)制。比如，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分離或誘導(dǎo)地克珠利耐藥球蟲(chóng)株，比較藥物敏感株和耐藥株在這些地克珠利可能作用的基因，篩選可能的耐藥基因的突變區(qū)域和突變位點(diǎn)，尋找地克珠利作用的靶基因位點(diǎn)，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)這些基因位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。地克珠利以及其他抗球蟲(chóng)藥物的靶基因或靶基因位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，將對(duì)抗球蟲(chóng)新藥的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。