鄭會(huì)強(qiáng) 崔曉利 竇權(quán)利 康磊 李愛芳 楊翰 劉元 談小文 黨麗云

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)在結(jié)核病中占0.5%～1.0%[1],由結(jié)核分枝桿菌(MTB)經(jīng)血液循環(huán)侵入顱內(nèi)或經(jīng)其他途徑播散至顱內(nèi)而引起的腦膜、脊膜、腦實(shí)質(zhì)、腦血管等的慢性非化膿性炎癥，其發(fā)病隱匿，缺乏快速、敏感的診斷方法，導(dǎo)致診斷治療不及時(shí),因而死亡及致殘的發(fā)生率較高。

MTB具有抗酸性、多形性、抵抗力強(qiáng)、菌體結(jié)構(gòu)復(fù)雜和生長緩慢等特殊的生物學(xué)特性[2]，致使TBM的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，腦脊液、血液等指標(biāo)變化不明顯，病原學(xué)檢查敏感度不高，難以與病毒性、化膿性、隱球菌性等腦膜炎相鑒別。目前診斷TBM主要依賴于臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)、腦脊液生化、腦脊液常規(guī)、腦脊液培養(yǎng)、抗酸染色、分子生物學(xué)，以及免疫學(xué)檢查等。筆者回顧性分析BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960法”)、改良抗酸染色(簡稱“MZN法”)、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert法”)、熒光探針法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡稱“PCR-熒光探針法”)和結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)等5種實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)對(duì)西安市胸科醫(yī)院TBM疑似患者腦脊液進(jìn)行檢測的結(jié)果，探討以上5種方法在TBM早期診斷中的價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、 研究對(duì)象

回顧性分析西安市胸科醫(yī)院2017年1月至2018年4月期間收治的成年疑似結(jié)核性腦膜炎患者244例，以2010年國際TBM協(xié)作組制定[3]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(臨床評(píng)分≥6分)為診斷標(biāo)準(zhǔn)(表1)，最終篩選出104例患者，患者腦脊液均進(jìn)行上述5種技術(shù)檢測。104例患者分為4組：(1)確診組(36例)：符合臨床癥狀和體征，進(jìn)行腦脊液抗酸染色檢查出抗酸桿菌，或者進(jìn)行腦脊液MTB培養(yǎng)陽性或核酸檢測陽性；(2)很有可能組(23例)：符合臨床癥狀和體征，同時(shí)臨床評(píng)分≥10分(無神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn))或臨床評(píng)分≥10分(伴有神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn))；(3)可能組(12例)：符合臨床癥狀和體征，臨床評(píng)分6～9分(無神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn))或臨床評(píng)分6～11分(伴有神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn))；(4)非TBM組(33例)：不符合國際TBM組制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(臨床評(píng)分<6分)。本研究獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，4組患者均簽署知情同意書。

確診組、很有可能組和可能組共71例，作為TBM組；其中，男39例，女32例；年齡18～74歲，平均(34.1±19.2)歲。非TBM組33例患者，包括臨床評(píng)分<6分的疑似結(jié)核性腦膜炎患者18例、化膿性腦膜炎6例、病毒性腦膜炎4例、隱球菌性腦膜炎5例。

二、實(shí)驗(yàn)室方法

1. MGIT 960法[4]:儀器為BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD醫(yī)療器械有限公司)，試劑為MGIT液體培養(yǎng)管(美國BD醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)為6140573)，分枝桿菌培養(yǎng)添加劑(美國BD醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)為6293546)等。參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》取患者0.5 ml腦脊液接種于加有分枝桿菌培養(yǎng)添加劑的液體培養(yǎng)管中，同時(shí)按同樣方法接種0.5 ml 1麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)稀釋100倍后的稀釋菌液(質(zhì)控樣本,6～10 d顯示陽性結(jié)果則質(zhì)控合格)，混勻后放入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)，儀器培養(yǎng)報(bào)陽后取培養(yǎng)后的菌液行萋-尼抗酸染色，確認(rèn)是否為抗酸桿菌，然后行MTB抗原檢測(MPB64蛋白抗原；杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)。

2. MZN法[5]：儀器為BX43醫(yī)用光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，F(xiàn)MV-6微型細(xì)胞玻片離心沉淀器，試劑為BASO結(jié)核菌染色液(冷染法)(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為417021)。取患者0.5 ml腦脊液、H37Rv(陽性質(zhì)控)和已知健康人群痰液(陰性質(zhì)控)分別加入FMV-6微型細(xì)胞玻片離心沉淀器的沉淀管中，50×g離心3 min，保證腦脊液標(biāo)本中的有形成分完全沉淀至掛膠玻片上；然后將微型細(xì)胞玻片浸于甲醛丙酮固定液中30 s；再將固定后的玻片浸泡于0.3% Triton X-100破膜液中30 min，后用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液洗3次；最后行抗酸染色，顯微鏡下判斷是否存在抗酸桿菌。

表1 結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷評(píng)分

3.GeneXpert 法[6]：儀器為GeneXpert MTB/RIF分析儀(美國Cepheid公司)，配套試劑為GeneXpert法檢測試劑盒(美國Cepheid公司，批號(hào)為1000032621)。取患者1 ml腦脊液按試劑盒說明書操作進(jìn)行標(biāo)本前處理，然后上機(jī)檢測，得出結(jié)果[循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)小于40結(jié)果判定為陽性]。同時(shí)根據(jù)試劑盒說明書要求，做樣本處理質(zhì)控和探針質(zhì)控。

4.PCR-熒光探針法[7]：儀器為ABI 7500熒光PCR檢測系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物公司)，配套試劑為分枝桿菌核酸檢測試劑盒(北京博奧生物科技有限公司，批號(hào)為0112161708和0105171801)。取患者1 ml 腦脊液和已知健康人群痰液(陰性質(zhì)控)按試劑盒說明書要求進(jìn)行標(biāo)本前處理，同時(shí)取0.5麥?zhǔn)蠁挝籋37Rv菌懸液提取核酸調(diào)至1×1010IU/ml作為陽性質(zhì)控，然后上機(jī)檢測，擴(kuò)增曲線呈S型且Ct值小于40結(jié)果判定為陽性。

5. T-SPOT.TB[8]：儀器為BX43醫(yī)用光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，試劑為T-SPOT.TB檢測試劑盒(免疫斑點(diǎn)法)(英國牛津公司，批號(hào)為TEC208772和TEC333862)。取患者4 ml腦脊液按試劑盒說明書要求進(jìn)行前處理，同時(shí)按試劑盒說明書要求處理陽性對(duì)照質(zhì)控(斑點(diǎn)數(shù)超過20個(gè)為試驗(yàn)合格)，然后得到保證細(xì)胞數(shù)量為2.5×106個(gè)/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)孵育后斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，得出結(jié)果(陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)，且A孔或B孔與空白孔的斑點(diǎn)數(shù)的差值≥6；(2)空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)時(shí)，且A孔或B孔斑點(diǎn)數(shù)≥兩倍空白孔斑點(diǎn)數(shù))。

將MGIT 960法、MZN法、GeneXpert法、PCR-熒光探針法和T-SPOT.TB等5種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)分為4個(gè)組，A組為細(xì)菌學(xué)方法組，包括MGIT 960法和MZN法；B組為分子生物學(xué)方法組，包括GeneXpert法和PCR-熒光探針法；C組為免疫學(xué)方法組，包括T-SPOT.TB；D組為聯(lián)合診斷組，包括以上5種試驗(yàn)；綜合比較5種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)診斷TBM敏感度和4種方法組診斷TBM敏感度的差異。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 實(shí)驗(yàn)室檢查基本情況

均行MGIT 960法、MZN法、GeneXpert法、PCR-熒光探針法和T-SPOT.TB檢測的71例患者中，MGIT 960法陽性14例，陰性57例；MZN法陽性19例，陰性52例；GeneXpert法陽性30例，陰性41例；PCR-熒光探針法陽性25例，陰性46例；T-SPOT.TB陽性21例，陰性50例。

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert法和PCR-熒光探針法的敏感度高于MGIT 960法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.43，P=0.004；χ2=4.28，P=0.039)；MZN法和T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感度與MGIT 960法比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.99，P=0.320；χ2=1.85，P=0.242)，見表2。

二、 不同方法組間檢測效能的比較

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌學(xué)方法組、分子生物學(xué)方法組、免疫學(xué)方法組和聯(lián)合診斷組的敏感度分別為31.0%、50.7%、29.6%、73.2%。見表3。分子生物學(xué)方法組和聯(lián)合診斷組的敏感度高于細(xì)菌學(xué)方法組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.71，P=0.017；χ2=73.20，P=0.000)。

討 論

TBM是最常見的肺外結(jié)核之一，占肺外結(jié)核的5%～10%[9]。TBM患者死亡率高，多發(fā)生在發(fā)病初6個(gè)月，病死率可達(dá)26.8%[10]，因此早期快速的實(shí)驗(yàn)室診斷方法能夠?yàn)榛颊叩闹委熀皖A(yù)后提供較大幫助。目前關(guān)于TBM早期快速診斷的實(shí)驗(yàn)室方法研究較多，各研究者對(duì)細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方法的報(bào)道不盡相同。

本研究MGIT 960法檢測的敏感度為19.7%，Rajeev 等[11]報(bào)道MTB培養(yǎng)敏感度為10%～30%，Philip等[12]報(bào)道MTB培養(yǎng)敏感度為10%～71%，由此可見，MTB培養(yǎng)敏感度差異較大。本研究考慮到MGIT 960法液體培養(yǎng)陽性只能說明是分枝桿菌復(fù)合群，也可能存在非結(jié)核分枝桿菌，因此用培養(yǎng)陽性后的菌液做MTB抗原檢測試驗(yàn)，確認(rèn)其為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。但是MGIT 960法培養(yǎng)周期長，不能滿足TBM的早期快速診斷。腦脊液涂片Z-N法檢測的敏感度低，只有10%左右，并且只能檢測到細(xì)胞外抗酸桿菌[13]，吳海峰[14]報(bào)道抗結(jié)核藥物作用于MTB細(xì)胞壁，導(dǎo)致部分MTB的L型(MTB-L)出現(xiàn)，其細(xì)胞壁不完整，抗酸染色時(shí)細(xì)菌體不易著色，或者著色極淡，進(jìn)而使得抗酸桿菌的檢出率降低。因此本研究采用改良抗酸染色法(MZN法)[5]，將患者腦脊液離心、固定、破膜后行抗酸染色，然后顯微鏡下找抗酸桿菌，最終敏感度為26.8%。此方法能檢測細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的抗酸桿菌，且可在患者接受治療6.5個(gè)月后檢出[15-16]，因此MZN法敏感度明顯高于Trusov 等[17]報(bào)道的傳統(tǒng)抗酸染色(Z-N法)10%左右。但是腦脊液抗酸染色是在顯微鏡下找抗酸陽性桿菌，并不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌，且容易受到標(biāo)本采集、抗結(jié)核藥物和實(shí)驗(yàn)者主觀因素的影響?？梢?，雖然MZN法敏感度明顯高于Z-N法，但仍然不能滿足臨床需求。

表2 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)5種實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)檢測104例患者腦脊液的效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表3 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)4種方法組檢測104例患者的敏感度

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

分子生物學(xué)方法近年來成為研究熱點(diǎn)，2017年新版肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》)[18]中推薦分枝桿菌核酸檢測為結(jié)核病診斷的參考標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究采用PCR-熒光探針法，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入熒光探針，把核酸擴(kuò)增、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起，保證整個(gè)過程在單管中進(jìn)行，最大限度地降低了PCR產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)的污染[19]。最終得出PCR-熒光探針法在TBM診斷中的敏感度為35.2%，高于MGIT 960法的19.7%。Hannan 等[20]報(bào)道PCR在MTB的DNA檢測中的敏感度為31%～100%，特異度為66%～100%，由于單一的靶基因擴(kuò)增，某些TBM患者中可能沒有這些基因，此外MTB的細(xì)胞壁有一個(gè)不透水的復(fù)雜結(jié)構(gòu)使細(xì)胞溶解困難，從而導(dǎo)致核酸含量低，這些因素均可能導(dǎo)致一定的假陰性，因此單一的PCR-熒光探針法試驗(yàn)在TBM的診斷中也存在很多缺點(diǎn)。WHO推薦GeneXpert法檢測作為TBM初次檢測的優(yōu)先方案，該方法在TBM的早期診斷中有巨大優(yōu)勢[21-22]。近年來，國內(nèi)外對(duì)GeneXpert法新型分子診斷平臺(tái)在肺結(jié)核、肺外結(jié)核、耐藥結(jié)核病，以及結(jié)核病并發(fā)HIV感染等疾病中的研究層出不窮。本研究采用GeneXpert法檢測的敏感度達(dá)42.3%，明顯高于MGIT 960法，且與楊元利等[23]報(bào)道的采用GeneXpert法在TBM患者腦脊液檢測中的敏感度(41%)差距不大，與劉銳等[24]報(bào)道GeneXpert法檢測TBM的敏感度(43.1%)相差較小。由此可見，GeneXpert法診斷的敏感度優(yōu)于MGIT 960法，其快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)對(duì)TBM的早期診斷、治療和預(yù)后幫助很大；同時(shí)其可以檢測利福平耐藥情況。因此，GeneXpert法比較適合在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家推廣使用。由于GeneXpert法僅憑單一的靶基因擴(kuò)增和檢測單一的rpoB基因耐藥決定區(qū)，可能導(dǎo)致產(chǎn)生一定的假陰性，其在TBM的診斷中仍然需要與其他實(shí)驗(yàn)室方法聯(lián)合使用，以提高敏感度、降低假陰性率。

有報(bào)道認(rèn)為，血清學(xué)檢測方法不能作為診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)[25]，但是其對(duì)菌陰肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的診斷具有較高的敏感度，2017年新版肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》)[18]中將γ-干擾素釋放試驗(yàn)等納入其中。因此，筆者研究T-SPOT.TB在TBM診斷中的效能，得出其在TBM中的敏感度為29.6%，稍高于MGIT 960法的敏感度。吳長靜[26]報(bào)道T-SPOT.TB在檢測腦脊液中的敏感度達(dá)97.1%，段素霞[27]報(bào)道T-SPOT.TB檢測腦脊液的敏感度為91.1%，筆者得出的敏感度低于以上研究。分析原因主要有兩點(diǎn)：一是本研究41例患者標(biāo)本的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量小于2.5×106個(gè)/ml，不符合試驗(yàn)要求，結(jié)果判定為陰性，導(dǎo)致敏感度降低；二是由于長時(shí)間抗結(jié)核藥物治療過程中，MTB效應(yīng)T細(xì)胞存活周期變短，進(jìn)而導(dǎo)致T-SPOT.TB檢測結(jié)果呈假陰性。另外，T-SPOT.TB能否區(qū)別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性肺結(jié)核仍然有待商榷。總體而言，在TBM患者腦脊液滿足實(shí)驗(yàn)要求的情況下，T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感度和特異度較高，其在TBM的早期診斷中發(fā)揮著較大作用。

在TBM的診斷中，各種實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)均存在一定不足，MZN法敏感度低，MGIT 960法實(shí)驗(yàn)周期長，PCR-熒光探針法和GeneXpert法存在一定的假陰性，T-SPOT.TB對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本質(zhì)量要求較高，且可能無法區(qū)分結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性肺結(jié)核。因此，筆者嘗試研究細(xì)菌學(xué)方法組、分子生物學(xué)方法組、免疫學(xué)方法組和聯(lián)合診斷組的敏感度，得出4種方法組的敏感度分別為31.0%、50.7%、29.6%、73.2%。由此可見，不同檢測技術(shù)間綜合后的敏感度較單一檢測技術(shù)有所提高，細(xì)菌學(xué)方法組一定程度上彌補(bǔ)了MZN法敏感度低、MGIT 960法實(shí)驗(yàn)周期長的不足，分子生物學(xué)方法組一定程度上降低了單一檢測技術(shù)的假陰性率，聯(lián)合診斷組大大提升了實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)在TBM早期診斷中的敏感度，不同程度克服了各單一檢測技術(shù)的缺點(diǎn)，但是其對(duì)患者經(jīng)濟(jì)條件要求較高。

綜上所述，本研究所采用的5種實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)在TBM的診斷中各有其優(yōu)缺點(diǎn)，其中分子生物學(xué)方法的敏感度優(yōu)于MGIT 960法和MZN法，且檢測周期短，建議作為TBM早期快速診斷的優(yōu)選方案。在實(shí)際臨床工作中，建議根據(jù)患者經(jīng)濟(jì)條件、抗結(jié)核治療時(shí)機(jī)、抗結(jié)核藥物的選擇及實(shí)驗(yàn)室條件等綜合因素，選擇合適的聯(lián)合檢測方法，以提高TBM診斷的敏感度，降低各類檢測技術(shù)診斷的假陰性率，進(jìn)而最大限度地幫助TBM患者得到早期快速診斷，減少誤診和漏診，促進(jìn)對(duì)TBM患者進(jìn)行早期規(guī)范的治療，降低致殘率和死亡率，改善TBM患者的預(yù)后。