李勇 于翠 莫榮利 鄧文 熊超 莊楚雄 胡興明

摘要：研究高產(chǎn)桑品種鄂桑1號（E1）和對照桑品種湖桑32號（H32）光合特性及光合相關(guān)基因表達(dá)變化，為桑樹高光效育種以及種質(zhì)資源篩選提供理論依據(jù)。利用LI-6400XT型便攜式光合測定儀測定桑樹葉片氣體交換和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，同時(shí)測定葉綠素含量和1，5二磷酸核酮糖羧化酶（RUBP）活性，在桑樹光合日變化曲線峰值和谷底取樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較不同桑品種光合相關(guān)基因表達(dá)的差異。對E1和H32的光合日變化測定結(jié)果顯示，桑品種E1葉片的Pn峰值顯著大于H32峰值（P<0.05），H32葉片Tr峰值顯著大于E1峰值（P<0.05）;不同品種桑樹葉片Pn-PAR和Pn-Ci的響應(yīng)中，CE、CSP為E大于H32，AQY、LCP、LSP、CCP為H32大于E1。E1在較弱光強(qiáng)下實(shí)現(xiàn)光合產(chǎn)物積累的能力強(qiáng)于H32，E1對CO2低濃度的利用效率優(yōu)于H32;不同桑品種葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，E1葉片ΦPSⅡ和qP顯著大于H32（P<0.05），H32的NPQ顯著大于E1（P<0.05），表明H32葉片吸收的光能較多的以熱能的形式進(jìn)行耗散;H32的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素含量均顯著小于E1（P<0.05），E1的RUBP活性大于H32（P>0.05），表明E1光合能力優(yōu)于H32。不同品種不同時(shí)段發(fā)現(xiàn)3 356個(gè)差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs），代謝通路分析顯示共有1 136個(gè)DEGs注釋到KEEG數(shù)據(jù)庫，DEGs顯著富集的光合作用相關(guān)代謝通路主要是光合作用固碳、碳代謝、卟啉和葉綠素代謝等3條光合相關(guān)代謝通路。在FC≥2且FDR<0.01的高差異表達(dá)基因中篩選功能描述與光合作用相關(guān)的新基因共10個(gè)。其中Mulberry_newGene_3646、Mulberry_newGene_1405、Mulberry_newGene_2419和Mulberry_newGene_320共4個(gè)DEGs可能是造成H32和E1凈光合速率和產(chǎn)量差異的關(guān)鍵基因，可重點(diǎn)研究。

關(guān)鍵詞：桑樹（Morus alba L.）;光合特性;葉綠素?zé)晒馓匦?轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：S888? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0101-11

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.023? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Research on mulberry photosynthesis transcriptome

LI Yong1，2，YU Cui2，MO Rong-li2，DENG Wen2，XIONG Chao2，ZHUANG Chu-xiong1，HU Xing-ming2

（1.College of Life Sciences，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;

2.Economic Crops Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： The photosynthesis characteristics and photosynthetic related gene expression of high-yield mulberry varieties Esang 1 （E1） and control mulberry variety Husang 32（H32） were studied to provide a theoretical basis for high-efficiency breeding of mulberry trees and screening of germplasm resources. Using LI-6400XT mulberry leaf gas exchange and chlorophyll fluorescence parameters， chlorophyll content and ribulose carboxylase（RUBP） activity were measured simultaneously， transcriptome sequencing was performed on the peaks and valleys of mulberry photosynthesis curves， and the differences in photosynthetic related gene expression among different mulberry varieties were compared. The results of photosynthetic variation of E1 and H32 showed that the Pn peak of E1 leaves was significantly larger than that of H32（P<0.05）， and the peak of Tr of H32 leaves was significantly larger than that of E1 （P<0.05）. In the Pn-PAR and Pn-Ci responses of different mulberry leaves， CE and CSP were E1>H32， AQY， LCP， LSP and CCP were H32>E1. The ability of E1 to achieve photosynthetic product accumulation under weaker light intensity is stronger than that of H32， and the utilization efficiency of E1 to low concentration CO2 is better than that of H32; among the chlorophyll fluorescence parameters of different mulberry varieties， ΦPSII and qP of E1 leaves were significantly higher than H32 （P<0.05）， and NPQ of H32 was significantly larger than E1 （P<0.05）， indicating that the light energy absorbed by H32 leaves was mainly dissipated in the form of heat energy; the chlorophyll a， chlorophyll b and chlorophyll content of H32 were significantly lower than E1（P<0.05）， and the RUBP activity of E1 was higher than that of H32（P>0.05）， indicating that the photosynthetic capacity of E1 was better than that of H32. 3 356 DEGs were found in different varieties and different time periods. The metabolic pathway analysis showed that there were 1 136 DEGs annotated to the KEEG database. The photosynthesis-related metabolic pathways significantly enriched by DEGs were mainly photosynthetic carbon sequestration， carbon metabolism， porphyrin and chlorophyll metabolism. Photosynthetically related metabolic pathways. A total of 10 new genes related to photosynthesis were screened for highly differentially expressed genes with FC≥2 and FDR<0.01. The four DEGs， Mulberry_newGene_3646， Mulberry_newGene_1405， Mulberry_newGene_2419 and Mulberry_newGene_320， may be the key genes causing the difference in net photosynthetic rate and yield between H32 and E1， which can be studied intensively.

Key words： mulberry; photosynthetic characteristics; chlorophyll fluorescence characteristics; transcriptome

高等植物光合作用是其物質(zhì)生產(chǎn)的基礎(chǔ)[1]，過程復(fù)雜，受諸多因子影響，其中，植物自身的光合特性起主要作用。研究植物光合作用特性，探討高光效機(jī)制，在理論和實(shí)踐上都具有重大意義。

桑樹（Morus alba L.）桑屬桑科落葉喬木或灌木。桑葉作為家蠶（Bonbyx mori L.）的飼料，是養(yǎng)蠶業(yè)的重要基礎(chǔ)。桑葉還具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，被衛(wèi)生部列為藥食同源品種。已有桑樹光合作用研究多集中于逆境脅迫和栽培對光合特性的影響方面，鮮見自然條件下不同品種桑樹光合特性比較及其關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控研究報(bào)道。為系統(tǒng)和深入地探究自然條件下不同品種桑樹光合作用及產(chǎn)量差異機(jī)制，以主推高產(chǎn)桑品種鄂桑1號（E1）和對照桑品種湖桑32號（H32）為材料，比較光合作用上的主要差異，通過轉(zhuǎn)錄組分析差異涉及的基因及基因表達(dá)特征，探究自然條件下不同桑品種光合特性及其產(chǎn)量差異機(jī)制，為桑樹高光效育種及種質(zhì)資源篩選提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

鄂桑1號（E1）和湖桑32號（H32）1996年栽植于湖北省桑樹種質(zhì)資源圃，典型黃棕壤性土，肥力適中，pH 5.6～6.5，有機(jī)質(zhì)含量中等偏上，株行距133 cm×67 cm，中干養(yǎng)成。小區(qū)地面平整、土地肥力均一，每小區(qū)選3株干周、冠徑、樹勢基本一致的桑樹為試材，重復(fù)3次，按高產(chǎn)桑園進(jìn)行肥水管理，夏伐，強(qiáng)化病蟲害防治和疏芽，確保良好的產(chǎn)葉群體結(jié)構(gòu)。2014—2017年進(jìn)行調(diào)查。

1.2? 測定方法

1.2.1? 光合生理參數(shù)測定? 選樣株中3個(gè)光照良好的頂部新梢，每新梢選1片功能正常葉片（5～7位葉片），用便攜式光合測定儀（美國LI-COR公司，LI-6400XT型）測定桑葉凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間二氧化碳濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）[2]。5月12—13日6：00—18：00每隔2 h測定1次。光合有效輻射（PAR）從0～1 800 μmol/（m2·s）設(shè)定14個(gè)梯度，大氣CO2濃度為400 μmol/mol。以直線回歸（0～200 μmol/（m2·s））求得Pn-PAR響應(yīng)曲線的初始斜率dPn/dPAR，即為表觀光合量子效率（AQY），同時(shí)計(jì)算光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP），飽和光強(qiáng)（LSP）利用擬合曲線方程（y=ax2+bx+c）計(jì)算[3]。Ci設(shè)定12個(gè)濃度梯度（0～1 500 μmol/mol），PAR為1 200 μmol/（m2·s）。以直線回歸（0～200 μmol/mol）求得Pn-Ci響應(yīng)曲線的初始斜率dPn/dCi，即為羧化效率（CE）。CO2補(bǔ)償點(diǎn)（CCP）與飽和點(diǎn)（CSP）以Pn-Ci響應(yīng)曲線方程計(jì)算[4，5]。

1.2.2? 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定? 5月15—16日用便攜式光合測定儀（美國LI-COR公司，LI-6400XT型）配備的熒光葉室測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。葉位、葉片選擇同“1.2.1”。試驗(yàn)前用錫箔紙將待測葉片包裹進(jìn)行12～24 h遮光處理，5：30—7：00準(zhǔn)確測定，重復(fù)6次。測定最小初始熒光（Fo）、暗適應(yīng)最大熒光（Fm）、最大熒光（Fm′）、初始熒光（Fo′）。PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)猝滅（NPQ）以及PSⅡ的電子傳遞速率（ETR）由儀器自動計(jì)算給出。

PSⅡ最大量子效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm[6];PSⅡ?qū)嶋H量子效率ΦPSⅡ=△F/Fm′=（Fm′-Fs）/Fm′[6];表觀電子傳遞速率ETR=0.5×0.84×ΦPSⅡ×PPFD[7];光化學(xué)淬滅系數(shù)qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-F0′）;非光化學(xué)淬滅NPQ=（Fm-Fm′）/Fm′。

1.2.3? 理化指標(biāo)測定? 葉綠素含量測定采用丙酮提取法[8];1，5二磷酸核酮糖羧化酶（RUBP）活性測定采用分光光度計(jì)法[9]。

1.2.4? 光合轉(zhuǎn)錄組測序分析

1）RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序。分別在桑樹光合日變化曲線峰值和谷底取樣，液氮凍存，干冰凍存送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序。

2）測序數(shù)據(jù)分析。用To-pHat2軟件將過濾Raw

reads后得到的Clean reads與桑樹基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/17692）進(jìn)行序列比對。用Cufflinks軟件拼接Mapped Reads，并與已有基因組注釋信息比較，用BLAST軟件[10]進(jìn)行基因NR[11]，Swiss-Prot[12]，GO[13]，COG[14]，KOG[15]，Pfam[16]，KEGG[17]數(shù)據(jù)庫序列比對，用KOBAS2.0[18]得基因KEGG Orthology結(jié)果，用HMMER[19]軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫比對氨基酸序列，獲得基因注釋信息。將表達(dá)差異倍數(shù)Fold Change≥2且FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用Cufflinks對基因表達(dá)水平進(jìn)行定量，以FPKM表示。以Fold Change≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出2個(gè)光合相關(guān)差異表達(dá)基因，進(jìn)行GO分類和功能統(tǒng)計(jì)，KEGG注釋Unigene的Pathway。

1.3? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證內(nèi)參基因?yàn)樯銩CTIN，使用在線軟件設(shè)計(jì)引物（http：//www.ncbi.nlm.

nih.gov/tools/primer-blast/），要求PCR產(chǎn)物應(yīng)盡可能跨越外顯子-外顯子連接，以忽略DNA污染和選擇性剪接。用DNaseI處理總RNA，用Oligo（dT）（Takara，Japan）翻轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。qRT-PC使用SYBR Green Supermix iTaq試劑盒。20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，55 ℃10 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。相對定量采用2-ΔΔCt方法[20]計(jì)算。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均取平均值，用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同桑樹品種葉片光合日變化

6：00—18：00 Pn均呈典型的雙峰曲線（圖1A），第一峰值出現(xiàn)在10：00，第二峰值出現(xiàn)在14：00，E1和H32 Pn峰值分別為34.56 μmol/（m2·s）和32.65 μmol/（m2·s），E1葉片Pn峰值顯著大于H32峰值（P<0.05）;Gs和Ci均呈逐漸下降趨勢（圖1B，圖1C），Tr為單峰曲線（圖1D），從6：00開始上升，12：00達(dá)最大值，之后開始下降，18：00降至最低，其中E1和H32葉片Tr峰值分別為6.30 mmol/（m2·s）和10.56 mmol/（m2·s），H32葉片Tr峰值顯著大于E1峰值（P<0.05）。

2.2? 不同品種桑樹葉片Pn-PAR和Pn-Ci的響應(yīng)

CE、CSP E1大于H32，AQY、LCP、LSP、CCP H32大于E1（表1）。H32和E1 LSP分別為1 500、? 1 400 μmol/（m2·s），LCP則分別為47.930、31.182 μmol/（m2·s），E1在較弱光強(qiáng)下光合產(chǎn)物積累能力強(qiáng)于H32。H32、E1的CCP分別為74.618、68.724 μmol/mol，表明E1對低濃度CO2利用效率優(yōu)于H32。2個(gè)品種CSP均在1 100 μmol/mol以上，且 E1大于H32，分別為1 212.5、1 162.5 μmol/mol，表明E1利用CO2濃度范圍大于H32[21]。

2.3? 不同桑樹品種葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)

初始熒光Fo的變化可以反映PSⅡ反應(yīng)中心的狀況或者熱能耗散的狀況，F(xiàn)m為黑暗中的最大熒光，指已經(jīng)過完全暗適應(yīng)后的光合機(jī)構(gòu)全部PSⅡ反應(yīng)中心都關(guān)閉時(shí)的熒光強(qiáng)度，這時(shí)所有的非光化學(xué)過程均達(dá)到最小[22]。由圖2A、圖2B知，2個(gè)桑品種的Fo和Fm無顯著差異（P>0.05）。Fv/Fm是PSⅡ最大的光化學(xué)量子產(chǎn)量，其大小反映了PSⅡ反應(yīng)中心原初光能的轉(zhuǎn)化效率，是反映光合機(jī)構(gòu)生理狀態(tài)的重要熒光參數(shù)[23]。由圖2C可以看出，E1和H32葉片的初始熒光均沒有顯著變化。ΦPSⅡ是PSⅡ?qū)嶋H的光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映被用于光化學(xué)途徑的激發(fā)能占進(jìn)入到PSⅡ總激發(fā)能的占比，是植物光合能力的重要指標(biāo)，而光化學(xué)淬滅系數(shù)qP反映的是PSⅡ天線色素所吸收的光能被用于光化學(xué)反應(yīng)的光能，要使光化學(xué)淬滅系數(shù)保持較高的狀態(tài)，就要使PSⅡ反應(yīng)中心處于“開放”，因此光化學(xué)淬滅系數(shù)在一定程度上也反映了PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度[24，25]。由圖2D、圖2E可知，不同品種桑樹ΦPSⅡ和qP各異，E1葉片ΦPSⅡ和qP顯著大于H32（P<0.05）。非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ反映的是PSⅡ天線色素所吸收的光能沒有被用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的部分[26]，而ETR為表觀光合電子傳遞速率[27]。由圖2F、圖2G知，不同品種桑樹NPQ和ETR各異，H32葉片ΦPSⅡ和qP顯著大于E1（P<0.05）。

2.4? 不同桑樹品種葉片葉綠素含量及RUBP活性

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用時(shí)吸收和傳遞光能的重要功能物質(zhì)，其含量的高低反映植物光合作用強(qiáng)弱[28];1，5二磷酸核酮糖羧化酶（RUBP）是光合作用關(guān)鍵酶，在卡爾文循環(huán)中催化二氧化碳固定，生成2分子3-磷酸甘油酸（3-PGA），還可催化將氧加在RUBP的C-2位置下生成1分子的磷酸乙醇和1分子的3-磷酸甘油酸，反應(yīng)速率由氧氣和二氧化碳的濃度比調(diào)節(jié)，即調(diào)節(jié)光合作用和光呼吸平衡，決定凈光合速率，影響光合作用的強(qiáng)弱[29]。葉綠素含量和RUBP活性情況見圖3。由圖3A可知H32的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素含量均顯著小于E1（P<0.05），圖3B顯示，E1的RUBP活性大于H32，但差異不顯著（P>0.05）。

2.5? 不同桑樹品種光合轉(zhuǎn)錄組測序分析

2.5.1? 不同品種桑樹差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)? H32樣品2個(gè)時(shí)段測序得到的Clean reads數(shù)分別為23 136 096條和27 147 665條，E1樣品2個(gè)時(shí)段測序得到的Clean reads數(shù)分別為27 641 855條和30 242 866條，Q30堿基占比均超過94%，測序質(zhì)量較好。對2個(gè)桑品種10：00（TE）和12：00（TW）（H32-10vsH32-12）樣品的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析（圖4），H32 10：00和12：00相比，共有507個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有297個(gè)，下調(diào)的有210個(gè);對E1 10：00和12：00（E1-10vsE1-12）樣品的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，10：00和12：00相比，共有585個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有339個(gè)，下調(diào)的有246個(gè)。對10：00 H32和E1樣品的基因（H32-10vsE1-10）進(jìn)行差異表達(dá)分析。H32和E1相比，共有1 179個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有781個(gè)，下調(diào)的有398個(gè)。對12：00 H32和E1樣品的基因（H32-12vsE1-12）進(jìn)行差異表達(dá)分析。H32和E1相比，共有1 085個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的有612個(gè)，下調(diào)的有473個(gè)。

對2個(gè)品種2個(gè)時(shí)段共有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，如圖5。圖5展示的是在差異表達(dá)基因背景和全部基因背景下GO各二級功能的基因富集情況，體現(xiàn)兩個(gè)背景下各二級功能的地位，具有明顯比例差異的二級功能說明差異表達(dá)基因與全部基因的富集趨勢不同。差異基因在支鏈氨基酸合成過程、花青素生物合成過程、細(xì)胞器組裝、跨膜運(yùn)輸、防御反應(yīng)信號通路、甘氨酸合成過程等有顯著富集。

2.5.2? 不同品種桑樹差異表達(dá)基因KEEG分類注釋及光合作用相關(guān)基因差異表達(dá)? 對2個(gè)品種2個(gè)時(shí)段差異表達(dá)基因代謝通路分析結(jié)果見圖6。H32-10vsH32-12共有232個(gè)DEGs注釋到KEEG數(shù)據(jù)庫，E1-10vsE1-12共有190個(gè)DEGs注釋到KEEG數(shù)據(jù)庫，H32-10vsE1-10共有380個(gè)DEGs注釋到KEEG數(shù)據(jù)庫，H32-12vsE1-12共有334個(gè)DEGs注釋到KEEG數(shù)據(jù)庫。但不同桑品種不同時(shí)段注釋到光合作用碳固定、碳代謝、卟啉和葉綠素代謝等3條光合相關(guān)代謝通路的DEGs各異（表2）。生化過程代謝通路光合作用相關(guān)基因表達(dá)情況見表3，E1-10vsE1-12的光合作用碳固定中，描述為1，4-雙羥基-2-環(huán)烷酸聚丙基轉(zhuǎn)移酶的DEGs上調(diào)，而H32-10vsH32-12沒有;E1-10vsE1-12的卟啉和葉綠素代謝中，描述為葉綠素酶的DEGs下調(diào)，而H32-10vsH32-12沒有;品種間H32-12vsE1-12的光合作用碳固定中，描述為磷酸丙酮酸二激酶的DEGs下調(diào)，描述為依賴NADP的蘋果酶上調(diào)，但H32-10vsE1-10的光合作用碳固定中，該2個(gè)DEGs與H32-12vsE1-12的相同，但描述為光系統(tǒng)q（b）蛋白和磷烯醇丙酮酸羧化酶的DEGs分別呈下調(diào)和上調(diào);H32-12vsE1-12的卟啉和葉綠素代謝中，描述為葉綠素-1的DEGs上調(diào)，而H32-10vsE1-10中則無DEGs出現(xiàn)。

2.5.3? 光合相關(guān)基因篩選? 對H32-10vsH32-12和E1-10vsE1-12、H32-10vsE1-10和H32-12vsE1-12 GO數(shù)據(jù)庫功能注釋的1 092個(gè)和2 264個(gè)DEGs進(jìn)行分析，在FC≥2且FDR<0.01的高差異表達(dá)基因中篩選功能描述與光合作用相關(guān)的基因共10個(gè)。其中H32-10vsH32-12和E1-10vsE1-12、H32-10vsE1-10和H32-12vsE1-12中均包括3個(gè)下調(diào)基因和2個(gè)上調(diào)基因。10個(gè)DEGs在KOG class和Swiss Prot annotation的功能描述統(tǒng)計(jì)見表4、表5。從表4可以看出，H32-10vsH32-12和E1-10vsE1-12中的5個(gè)DEGs，KOG class為碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、防御機(jī)制、代謝產(chǎn)物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝的3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，而Swiss Prot注釋為Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase，chloroplastic （Precursor）和Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase，chloroplastic（Precursor）表達(dá)上調(diào);從表5可以看出 H32-10vsE1-10和H32-12vsE1-12中，Swiss Prot annotation注釋為Probable GTP diphosphokinase RSH3， chloroplastic（Precursor） GN=RSH3和Translocase of chloroplast 34，chloroplastic GN=MUG13.14以及Cytochrome P450 71A2 GN=CYP71A2的表達(dá)下調(diào)，而注釋為Cytochrome P450 71A1 GN=CYP71A1和Cytochrome P450 71D10 GN=CYP71D10的2個(gè)DEGs則表達(dá)上調(diào)。推測上述10個(gè)基因是造成同一品種不同時(shí)段、同一時(shí)段不同品種間凈光合速率差異的原因。

2.5.4? 熒光定量PCR驗(yàn)證? 選擇上述10個(gè)同一品種桑樹不同時(shí)段、同一時(shí)段不同品種桑樹的DEGs進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果見圖7。同一品種桑樹不同時(shí)段（圖7A、7B、7C、7D、7E）的5個(gè)DEGs除Mulberry_newGene_3423外，其他均呈顯著性差異（P<0.05），而同一時(shí)段不同桑品種（圖7F、7G、7H、7J）5個(gè)DEGs均呈顯著性差異（P<0.05），與測序結(jié)果分析基本一致。推測上述9個(gè)基因是造成同一品種不同時(shí)段、同一時(shí)段不同品種間凈光合速率差異的原因。其中同一品種不同時(shí)段中的Mulberry_newGene_3646，H32在10：00和12：00時(shí)的表達(dá)量均顯著小于E1，而同一時(shí)段不同桑品種中的Mulberry_newGene_1405、Mulberry_newGene_2419和

Mulberry_newGene_320，E1在10：00的表達(dá)量顯著大于H32，上述4個(gè)DEGs可能是造成H32和E1凈光合速率和產(chǎn)量差異的關(guān)鍵基因，可重點(diǎn)研究。

3? 討論

對E1和H32的光合日變化測定結(jié)果顯示，2個(gè)桑品種的氣體交換參數(shù)各異，但高產(chǎn)桑品種E1葉片的Pn峰值顯著大于H32的Pn峰值（P<0.05），H32葉片Tr峰值顯著大于E1的Tr峰值（P<0.05）;不同品種桑樹葉片Pn-PAR和Pn-Ci的響應(yīng)中，除CE、CSP為E1大于H32外，AQY、LCP、LSP、CCP均為H32大于E1。說明E1在較弱光強(qiáng)下實(shí)現(xiàn)光合產(chǎn)物積累的能力強(qiáng)于H32，E1對CO2低濃度的利用效率優(yōu)于H32。不同桑樹品種葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，E1葉片ΦPSⅡ和qP顯著大于H32（P<0.05），而H32的NPQ顯著大于E1（P<0.05），表明H32葉片吸收的光能較多地以熱能的形式進(jìn)行耗散;且H32的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素含量均顯著小于E1（P<0.05），而E1的RUBP活性大于H32，但差異不顯著（P>0.05）。表明E1光合能力優(yōu)于H32。

對2個(gè)桑品種 10：00和12：00樣品基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)3 356個(gè)DEGs，代謝通路分析顯示共有1 136個(gè)DEGs注釋到KEEG數(shù)據(jù)庫，DEGs顯著富集的光合作用相關(guān)代謝通路主要是光合作用固碳、碳代謝、卟啉和葉綠素代謝等3條光合相關(guān)代謝通路。根據(jù)對H32-10vsH32-12和E1-10vsE1-12、H32-10vsE1-10和H32-12vsE1-12 GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫功能注釋結(jié)果中的1 092個(gè)和2 264個(gè)DEGs進(jìn)行分析，在FC≥2且FDR<0.01的高差異表達(dá)基因中篩選功能描述與光合作用相關(guān)的基因10個(gè)。其中H32-10vsH32-12和E1-10vsE1-12、H32-10vsE1-10和H32-12vsE1-12中均包括3個(gè)下調(diào)基因和2個(gè)上調(diào)基因。熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，同一桑品種不同時(shí)段中的Mulberry_newGene_3646，H32在10：00和12：00時(shí)的表達(dá)量均顯著小于E1，而同一時(shí)段不同桑品種中的Mulberry_newGene_1405、Mulberry_newGene_2419

和Mulberry_newGene_320，E1在10：00的表達(dá)量顯著大于H32，上述4個(gè)DEGs可能是造成H32和E1凈光合速率和產(chǎn)量差異的關(guān)鍵基因，可重點(diǎn)研究。

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