姚麗萍， 陳紫薇， 張曉梅， 許正宏*， 陸茂林

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省微生物研究所有限公司，江蘇 無(wú)錫 214063）

L-絲氨酸 （L-serine）是人類非必需氨基酸之一，主要應(yīng)用于醫(yī)藥、化工及食品等多種相關(guān)領(lǐng)域。此外，L-絲氨酸作為生物體內(nèi)重要的一碳單位，是嘧啶、嘌呤等有機(jī)物的主要供體[1-2]。L-絲氨酸具有廣泛的市場(chǎng)前景及開(kāi)發(fā)潛力[3]。

目前，L-絲氨酸生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、蛋白水解法及微生物發(fā)酵法等[4-8]。其中，微生物發(fā)酵法與化學(xué)合成法及蛋白水解法相比，具有綠色環(huán)保、高效、產(chǎn)物易分離提取等優(yōu)點(diǎn)[3]。近年來(lái)，微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的研究主要集中在大腸桿 菌 （Escherichia coli） 及 谷 氨 酸 棒 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）上[9-12]。 谷氨酸棒桿菌SYPS-062 33a ΔSSA-PS是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)代謝改造構(gòu)建的能發(fā)酵蔗糖高產(chǎn)L-絲氨酸的菌株，其利用全合成培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵120 h，L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)25.31 g/L。利用廉價(jià)原料發(fā)酵一直是生物工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[13-14]，糖蜜作為制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，含有大量可發(fā)酵糖類，同時(shí)含有大量的微生物生長(zhǎng)所需的微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且價(jià)格低廉，可作為微生物發(fā)酵的替代原料。Wang等[15]利用Bacillus sp.XZL9發(fā)酵糖蜜可以獲得74.7 g/L的乳酸；Kotzamanidis等[16]以糖蜜為原料，利用Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，產(chǎn)量達(dá)88.0 g/L；Xu等[17]以糖蜜為原料，利用Corynebacterium glutamicum發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸，產(chǎn)量達(dá)34.5 mmol/L。但在將糖蜜作為微生物發(fā)酵原料時(shí)，需進(jìn)行預(yù)處理，以去除其中可能影響微生物發(fā)酵的膠體、鈣質(zhì)、灰分等[18-19]。

本文考察了不同的糖蜜預(yù)處理方法、添加量對(duì)谷氨酸棒桿菌SYPS-062 33a ΔSSA-PS生長(zhǎng)及產(chǎn)L-絲氨酸的影響，并初步探討了糖蜜對(duì)絲氨酸合成相關(guān)途徑中關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，為該菌株高效發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗糖蜜：由山東正信集團(tuán)提供，總糖量48.20%。

重組谷氨酸棒桿菌（Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSA-PS）為江南大學(xué)藥學(xué)院制藥工程研究室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：

A：無(wú)水葡萄糖 20，115℃，7 min進(jìn)行滅菌。

B：BHI 37， （NH4）2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.2，NaH2PO40.3，自然 pH，115 ℃，7 min 進(jìn)行滅菌。

A+B混勻使用。

發(fā)酵全合成培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 100，（NH4）2SO430，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，原兒茶酸 0.03，生物素 0.5×10-3，硫酸硫胺素 4.5×10-3。滅菌條件：115 ℃，7 min。添加糖蜜時(shí)，通過(guò)換算隨后替代蔗糖加入或者添加一定量的糖蜜，定容，分裝，滅菌。

1.2 糖蜜預(yù)處理方法

1.2.1 EDTA法 糖蜜預(yù)先加水稀釋成質(zhì)量比為1∶1的混合溶液，用1 mol/L的HCl調(diào)pH至7.0，于沸水中加熱30 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)100×10-6的EDTA以加速重金屬物質(zhì)的沉積。將混合物于室溫下靜置24 h，然后12 000 r/min離心20 min，取上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 硫酸法 糖蜜預(yù)先加水稀釋成質(zhì)量比為1∶1的混合溶液，用1 mol/L的H2SO4調(diào)pH至3.0。將混合物于室溫下靜置24 h，然后12 000 r/min離心20 min，取上清。將上清用10 mol/L的NaOH調(diào)pH至5.5，取上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

大部分互聯(lián)網(wǎng)汽車金融公司規(guī)模較小，業(yè)務(wù)范圍難以全面鋪開(kāi)，所以更多地是針對(duì)汽車金融的細(xì)分市場(chǎng)，如二手車買(mǎi)賣中涉及的貸款。專注細(xì)分市場(chǎng)可以有效地滿足客戶的不同需求，提高客戶體驗(yàn)感，有助于深層次地挖掘客戶。

1.2.3 磷酸法 糖蜜預(yù)先加水稀釋成質(zhì)量比為1∶1的混合溶液，用1 mol/L的H2PO4調(diào)pH至3.0。于沸水中加熱30 min，將混合物于室溫下靜置24 h，然后12 000 r/min離心20 min，取上清。將上清用10 mol/L 的 Ca（OH）2調(diào)pH 至 5.5，12 000 r/min 離心30 min，取上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 活性炭法 糖蜜預(yù)先加水稀釋成質(zhì)量比為1∶1的混合溶液，于60℃下靜置24 h，經(jīng)活性炭吸附處理后，12 000 r/min離心30 min，上清進(jìn)行抽濾，除雜，濾液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 澄清法 糖蜜預(yù)先加水稀釋成質(zhì)量比為1∶1的混合溶液，利用聚丙烯酰胺（PAM）作為糖蜜預(yù)處理的澄清劑，于100 mL的糖蜜溶液中分別加入5 mL的21.9 g/L乙酸鋅溶液和10.6%的亞鐵氰化鉀，于室溫下靜置過(guò)夜，促進(jìn)澄清劑沉積。混合物于12 000 r/min離心20 min，取上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法 糖蜜預(yù)先加水稀釋成質(zhì)量比為1∶1的混合溶液，100 mL糖蜜溶液中加入20 g陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，混合體系于恒溫振蕩器中，250 r/min，30 ℃振蕩 6 h，12 000 r/min離心 20 min，上清用10 mol/L NaOH調(diào)pH至5.5，取上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 發(fā)酵前處理 分別測(cè)定原糖蜜及不同預(yù)處理后的糖蜜的總糖含量，調(diào)總糖含量至10%。

1.3.2 谷氨酸棒桿菌活化 甘油管接種劃線于固體種子培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)3～4 d。

1.3.3 種子培養(yǎng) 接種一環(huán)平板種子于液體種子培養(yǎng)基，30℃，120 r/min培養(yǎng) 28 h，使其 OD562=25。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，使其初始 OD562=1，30 ℃，120 r/min培養(yǎng) 120 h，每 12 h取一次樣，進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)定。

1.4qRT-PCR

RNA提取采用RNA抽提試劑盒 （上海生工生物有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR分別采用RayScriptcDNA SynthesisKit和 PowerqPCR PreMix試劑盒（上海捷瑞生物公司）。

選擇16s（RNA）作為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物。根據(jù)C.glutamicum ATCC 13032的基因序列，使用DNAMEN軟件設(shè)計(jì)EMP途徑相關(guān)基因的引物，如表1所示。

1.5 分析方法

生物量測(cè)定：取100 μL發(fā)酵液用1 mol/L HCl稀釋到適宜質(zhì)量濃度，利用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定。

氨基酸含量和糖濃度的測(cè)定：將不同時(shí)間的發(fā)酵液于4℃、14 000 r/min離心10 min，上清液用于氨基酸含量和糖濃度的測(cè)定。發(fā)酵液中蔗糖和果糖及氨基酸含量均采用HPLC測(cè)定[20-21]。糖蜜中總糖和葡萄糖含量采用菲林試劑法測(cè)定[19]。

表1 相關(guān)基因的引物Table 1 Primers list

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理方法對(duì)糖蜜中總糖含量的影響

糖蜜作為制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，可作為微生物發(fā)酵的替代原料[19]。作為微生物發(fā)酵原料時(shí)，糖蜜需進(jìn)行預(yù)處理，去除其中的膠體、鈣質(zhì)、灰分等。不同的預(yù)處理方法使得糖蜜組分及含量具有一定的差異。采用不同方法對(duì)糖蜜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理前后糖蜜中的總糖和葡萄糖含量如表2所示。糖蜜采用硫酸預(yù)處理后，促使多糖水解形成單糖形式，菌體可直接利用葡萄糖含量比預(yù)處理前增加了4.51倍。采用活性炭法、澄清法和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法對(duì)糖蜜進(jìn)行預(yù)處理后，總糖及葡萄糖含量與未處理時(shí)變化不大。采用磷酸預(yù)處理糖蜜可去除大量的灰分和膠體成分，去除雜質(zhì)較徹底，但同時(shí)也損耗了大量的糖類物質(zhì)，與余煒等[18]研究結(jié)果一致。

2.2 糖蜜代替蔗糖為碳源對(duì)重組谷氨酸棒桿菌生長(zhǎng)及L-絲氨酸生產(chǎn)的影響

搖瓶發(fā)酵考察糖蜜對(duì)重組菌生長(zhǎng)及生產(chǎn)L-絲氨酸的影響，以總糖為10%的糖蜜代替全合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。采用硫酸法、EDTA法和澄清法預(yù)處理的糖蜜對(duì)重組菌的菌體生長(zhǎng)較為有利，而磷酸法和樹(shù)脂法處理的糖蜜則對(duì)其生長(zhǎng)不利。但所有預(yù)處理后的糖蜜作為唯一碳源時(shí)均不利于該重組菌積累L-絲氨酸。總體而言，硫酸法處理的糖蜜對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸較好。以糖蜜為原料時(shí)，谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸也有相似的結(jié)果[19]。

表2 不同方法處理后糖蜜中糖類含量變化Table 2 Concentration of sugar by different methods of molasses

表3 不同預(yù)處理方法對(duì)重組菌株生長(zhǎng)及L-絲氨酸產(chǎn)量的影響Table 3 Effects of different methods of molasses on cell growth and L-serine production

2.3 糖蜜的添加量對(duì)重組菌株谷氨酸棒桿菌生長(zhǎng)及L-絲氨酸生產(chǎn)的影響

進(jìn)一步考察了硫酸法預(yù)處理的糖蜜的不同添加量對(duì)重組菌生長(zhǎng)及L-絲氨酸生產(chǎn)的影響，結(jié)果如表4所示。蔗糖中添加少量糖蜜有利于菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累，當(dāng)培養(yǎng)基中糖蜜的糖量為1%，蔗糖量為9%時(shí)為最好。這可能是由于糖蜜中含有的多種營(yíng)養(yǎng)因子（生物素、維生素等可在一定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。

進(jìn)一步考察了低質(zhì)量分?jǐn)?shù)糖蜜對(duì)重組菌生長(zhǎng)和L-絲氨酸生產(chǎn)的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)全合成培養(yǎng)基中添加糖蜜總糖量為0.24%的硫酸預(yù)處理糖蜜時(shí)，重組菌生物量最高，OD562可達(dá)76.37，且L-絲氨酸產(chǎn)量最高，可達(dá)32.76 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.33 g/g（表5），比對(duì)照組提高了29.44%。上述結(jié)果充分說(shuō)明了糖蜜在該重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成中更多發(fā)揮了促進(jìn)劑的作用，而非作為碳源。

表4 糖蜜和蔗糖為混合碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)和L-絲氨酸產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of the carbon of molasses and sucrose on cell growth and L-serine production

圖1 低質(zhì)量濃度糖蜜添加對(duì)菌體生長(zhǎng)和L-絲氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different molasses addition on cell growth and L-serine production

表5 糖蜜添加量對(duì)菌體糖酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度的影響Table 5 Effects ofdifferentmolassesaddition on productivity and yield of L-serine

在全合成培養(yǎng)基和添加總糖為0.24%的硫酸預(yù)處理糖蜜后的發(fā)酵過(guò)程結(jié)果表明（圖2），添加少量的糖蜜對(duì)菌株生長(zhǎng)的遲滯期無(wú)明顯影響，發(fā)酵至84～120 h時(shí)，菌株的生長(zhǎng)速度較對(duì)照組好，發(fā)酵至120 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OD562可達(dá)76.37，較對(duì)照組提高了23.82%；L-絲氨酸產(chǎn)量可達(dá)32.76 g/L，較對(duì)照組（25.31 g/L）提高了 29.44%。

圖2 重組菌在不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵過(guò)程Fig.2 Fermentation process of different mediums by the recombinant strain

2.4 糖蜜對(duì)EMP途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

谷氨酸棒桿菌以蔗糖為碳源，經(jīng)糖酵解（EMP）途徑，以3-磷酸甘油酸為前體合成L-絲氨酸。EMP途徑與菌體生長(zhǎng)有密切關(guān)系，實(shí)驗(yàn)表明微量糖蜜的添加對(duì)菌體生長(zhǎng)和積累L-絲氨酸均有促進(jìn)作用，為此考察了添加總糖量為0.24%的糖蜜 （不同預(yù)處理方法）對(duì)EMP途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果如圖3所示。添加少量添加糖蜜可促進(jìn)EMP途徑中相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，這可能是促進(jìn)產(chǎn)物積累的主要原因之一。在實(shí)驗(yàn)組（糖蜜處理方法：未處理、活性炭法、硫酸法）中，甘油酸激酶的編碼基因pgk的轉(zhuǎn)錄水平提高最顯著，分別提高了2.68、7.11和9.83倍。在實(shí)驗(yàn)組（糖蜜處理方法：澄清法、磷酸法、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法）中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因gap的轉(zhuǎn)錄水平提高最顯著，分別提高了5.67、7.05和3.34倍。EMP途徑的上調(diào)可能是由于糖蜜中含有大量的有機(jī)酸（檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸等）、吡啶、金屬離子（Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+）[22]。吡啶衍生物是維生素、酶的重要組成部分，金屬離子可參與酶促反應(yīng)，提高酶活，增加蛋白表達(dá)，蛋白質(zhì)表達(dá)量與基因轉(zhuǎn)錄水平在全局層面上有較高的相關(guān)性[23-24]。添加糖蜜提高EMP途徑相關(guān)基

圖3 qRT-PCR分析糖蜜對(duì)EMP途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Analysis of the effect of molasses on transcription of genes encoding in EMP by qRT-PCR

3 結(jié) 語(yǔ)

本文考察了糖蜜預(yù)處理方法及糖蜜添加量對(duì)C.glutamicum SYPS-062 33a ΔSSA-PS 發(fā)酵產(chǎn) L-絲氨酸過(guò)程的影響。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%蔗糖和1%糖蜜總糖為混合碳源有利于菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)L-絲氨酸。在以10%蔗糖作為碳源時(shí)，添加總糖為0.24%的硫酸法預(yù)處理糖蜜時(shí)，對(duì)重組菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)L-絲氨酸最有利。同時(shí)，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)糖蜜的添加提高了EMP途徑關(guān)鍵基因（pgi、pfkA、glpX、gap 及 pgk）的轉(zhuǎn)錄水平。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，發(fā)酵120 h，菌體生物量OD562、L-絲氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為76.37、32.76 g/L和0.33 g/g蔗糖，較對(duì)照組分別提高了23.82%、29.44%和29.44%。