苗麗娟，尹柏雙，張立春，劉東旭

2017年3月吉林市磐石某規(guī)?；i場28日齡仔豬，發(fā)病44頭，死亡5頭，病豬表現(xiàn)為皮膚表面有出血斑點、消瘦、體溫升高，剖檢腹股溝淋巴結、扁桃體腫大出血、纖維素滲出明顯、腸里面有氣體，然后進行實驗室診斷，確診為豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2 )感染。

PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)等相關疾病的主要病原，該病1991年在加拿大首次報道[1-2],由于PCV2具有致病性， 5～12周齡仔豬一旦感染，死亡率可高達40%-50% ;由于在淋巴細胞中PCV2亦可增殖，導致免疫細胞凋亡，因此造成豬免疫抑制，從而繼發(fā)PPV、PRRS及CSFV等相關疾病的感染[2-3]，經(jīng)常給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，引起各國重視。

1 材料和方法

DNA提取試劑盒(康為世紀有限公司生產)、TaqDNA聚合酶(含10 x Buffer 25mmo1/LMCl2) , dNTP、(寶生物工程(大連)有限公司生產);PK 15細胞(無PCV, HCV, PRV, PPV,PRRS,支原體等6種病原)。

1.1 樣品研磨及處理

自吉林磐石某豬場剖檢病死豬，分別采集疑似感染PCV2豬的肝臟、肺臟、腹股溝淋巴結、扁桃體。研磨采集到的組織病料，取上清，按照試劑盒說明書提取DNA，將提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 可疑組織的PCR擴增及鑒定

應用PCV2檢測引物，P1：ACA GGA TCC ATG GCA TCT TCA ACA C；P2：GAA AG CTTT TCA TTA AGG GTT AAG T；產物長度581 bp。PCR的反應體系為25 μL，DNA 3 μL、1 μL的P1/P2(20 pmol/μL)、3 μL dNTP(2.5 mmol/μL)，2.5 μL 的10×buffer、0.25 μL的 rTaq 酶、14.25 μL的滅菌水，反應條件為25個cycle，預變性 94 ℃ 5 min后，進入循環(huán) 94 ℃ 45S, 55 ℃ 45S, 72 ℃ 45S，72 ℃延伸 7 min。1.2 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，結果見圖1。

1.3 病毒的分離、鑒定

經(jīng)檢測后為陽性的病理組織的上清以0.22 μm的濾器濾過，接種PK-15細胞，按照1%比例接種，盲傳7代，常規(guī)方法提取DNA，最后加滅菌去離子水15 μL溶解，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增并測序

應用Oligo6.24軟件設計的PCV2全長引物，P1：5-CTGGCCCTGCTCCCCGATCAT-3，P2：5-GGGCCAGAATTCAACCTTAAC-3。PCR的反應體系為25 μL，1 μL的P3/P4(20 pmol/μL)、3 μL dNTP(2.5 mmol/μL)，2.5 μL 的10×buffer、0.25 μL的 rTaq 酶、14.25 μL的滅菌水，反應條件為35個cycle，預變性 94 ℃ 5 min后，進入循環(huán) 94 ℃ 50S, 54 ℃ 1 min, 72 ℃ 50S，72 ℃延伸 7 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，結果見圖2，將目的基因與PMD-18T載體連接后送大連寶生物工程公司測序。

圖1 病料檢測結果M:Marker DL-2000；1:陽性對照;2:扁桃體;3:腹股溝淋巴結；4:肝臟；5:肺臟;6:陰性對照

圖2 全基因PCR擴增1:全基因;M：DL2000 Marker;2：陰性對照

1.5 PCV-2結構蛋白二級結構的預測

運用DNAStar 軟件中Carnier-Robson方法、Chou-Fasman方法預測吉林新分離株PCV-2 Cap蛋白的二級結構。Carnier-Robson方法是采用計算特定結構的內部含有特定的氨基酸殘基傾向性來預測PCV2 Cap蛋白的二級結構，采用Chou-Fasman方法預測PCV2 Cap蛋白質的二級結構是通過計算氨基酸殘基的晶體結構而來[3]。

1.6 B細胞抗原表位預測

對結構蛋白疏水性進行分析，主要采用Kyte-Doolittle方法。Kyte-Doolittle方法是根據(jù)序列的氨基酸組成，預測蛋白質的疏水區(qū)和親水區(qū)[3]；結構蛋白抗原指數(shù)[4]通過Jameson-Wolf方法進行預測；結構蛋白表面可能性運用Emini方法進行預測，而后綜合評價PCV-2 Cap結構蛋白B細胞抗原表位的地位。

2 結果

2.1 病理組織PCR檢測結果

經(jīng)PCR檢測，在扁桃體、腹股溝淋巴結、肝臟組織中擴增出581目的帶，說明此頭豬感染PCV2，結果見圖1。

2.2 PCR 檢測傳代病毒及全基因克隆

將盲傳到第7代的病毒進行PCR擴增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 1780bp見到目的帶，說明此病毒分離成功，結果見圖2。

2.3 PCV-2 Cap蛋白二級結構的預測

使用Carnier-Robson方法預測PCV2 Cap蛋白二級結構，發(fā)現(xiàn)它并沒有形成α螺旋結構，但是形成許多β折疊結構，各個帶有長短不同轉角的折疊單元，會影響蛋白的柔韌性。該預測結果表明：一些小的α螺旋結構存在于Cap蛋白的跨膜區(qū)中(見圖3)。

運用Chou-Fasman方法預測PCV2 Cap蛋白二級結構，結果顯示：在第68-74aa、97-105aa、129-137aa、183-188aa、219-225aa區(qū)段存在有少量的α螺旋結構。但用該方法預測的β折疊結構主要位于第19-25aa、44-65aa、148-152aa、194-201aa、210-223aa，轉角結構較少(見圖3)。

圖3 Carnier-Robson和Chou-Fasman方法預測PCV2 Cap蛋白的二級結構A:α-螺旋結構；B:β-折疊；C:轉角區(qū)域；T:無規(guī)則卷曲

2.4 PCV-2 Cap蛋白親水性預測分析

如圖4所示，運用Kyte-Doolittle(1982)方法對PCV-2吉林新分離株的Cap蛋白進行預測，主要是通過蛋白質的氨基酸序列來進行親水性分析，正值為親水的，負值為疏水的。結果顯示該蛋白存在眾多親水性的區(qū)域，并且位于第1-45aa、84-103aa、173-193aa親水性指數(shù)較高， 位于第140-164aa、204-214aa、222-234aa也有親水性,表明此區(qū)域暴露在表面的概率很大，因此，成為抗原表位的概率極大。

圖4 PCV-2 Cap蛋白親水性預測分析

2.5 PCV-2 Cap蛋白的表面可能性預測分析

發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在PCV-2 Cap蛋白表面可能性很大的氨基酸區(qū)域，主要是位于第4-16aa、第32-43aa、第48-67aa、第95-103aa、第138-163aa、第173-181aa區(qū)段，如圖5所示，其它部位顯示為負值或展示的可能性較小。

圖5 PCV-2 Cap蛋白出現(xiàn)在表面可能性預測分析

2.6 PCV-2 Cap蛋白骨架區(qū)的柔韌性預測分析

PCV-2 Cap蛋白骨架區(qū)具有比較多的，且分布比較均勻的柔韌性區(qū)域，提示PCV-2 Cap蛋白發(fā)生折疊和扭曲的概率較高，肽段的柔韌性較高，可以形成豐富的二級結構(如圖 6)。

圖6 PCV-2 Cap蛋白骨架區(qū)的柔韌性預測分析

2.7 PCV-2 Cap 蛋白B細胞抗原表位的預測分析

通過綜合以上親水性分析、計算表面概率、骨架的柔韌性分析、預測蛋白質二級結構的方法進行分析，結果顯示:PCV-2 Cap蛋白含有許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域，既PCV-2 Cap 蛋白潛在的蛋白抗原決定簇，如第3-20aa、第57-67 aa、第82-91 aa、第108-121 aa、第154-171 aa、第225-234 aa區(qū)段，表明該區(qū)段具有潛在的優(yōu)勢抗原表位，如圖7。盡管有些肽段的抗原指數(shù)比較高，但由于其親水性或呈現(xiàn)表面概率較低，因此要綜合這些預測參數(shù)判斷其作為潛在抗原表位的可能性。

圖7 PCV-2 Cap 蛋白的抗原指數(shù)分析

3 討 論

3.1本研究主要是對PCV2吉林磐石新分離株的全基因進行克隆和測序，測序結果表明其在ORF2基因上變異較大，同時根據(jù)Cap 結構蛋白的特點使其成為在分子水平上檢測PCV2特異性的理想抗原。

3.2采用計算機和生物學軟件分析技術，預測和分析了PCV2 Cap蛋白的二級結構、潛在的B淋巴細胞的優(yōu)勢抗原表位。結果表明：在第3-20aa、第57- 67 aa、第82-91 aa、第108-121 aa、第154-171 aa、第225-234 aa區(qū)段具有潛在的優(yōu)勢抗原表位，Cap蛋白α螺旋的形成能力比較差，但是形成許多β-折疊和轉角結構單元，可能與該蛋白氨基酸的結構組成有關，所以該分離株Cap蛋白二級結構復雜。