劉凡銘 郭美薇 鄒 偉

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 大連 116021)

人體腸道中棲息著數(shù)量巨大的微生物，它們的種類組成和活動(dòng)影響著宿主的免疫、黏膜的發(fā)育和營養(yǎng)及藥物的代謝[1]。腸道菌群研究中如何準(zhǔn)確有效地選擇菌群的檢測方法十分關(guān)鍵。目前腸道菌群的檢測方法大致分為兩大類，即傳統(tǒng)培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法。前者具有一定的局限性，如對(duì)于許多表型特征難以區(qū)別的菌種傳統(tǒng)分類鑒定方法就無法準(zhǔn)確加以鑒定；后者借助分子生物學(xué)技術(shù)，可以對(duì)腸道菌群進(jìn)行精準(zhǔn)的、分子水平的檢測和分析。目前常用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)包括16S rDNA基因序列分析法、腸桿菌基因間重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction， ERIC-PCR)技術(shù)、熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization)、基因芯片技術(shù)(gene chip)及高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing)等，本文概述這些技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 16 S rRNA基因序列分析法

16 S rRNA基因是沉降系數(shù)為16的RNA片段，存在于所有細(xì)菌的基因組中。16S rRNA基因序列分析法利用克隆和酶切等方法從細(xì)菌樣本中獲得16S rRNA，并將其與基因文庫中細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，從而鑒定菌群的種類。

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，能將微量的DNA大幅增加。其原理是利用DNA在體外95℃高溫時(shí)變性為單鏈，在60℃左右時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72℃左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖的方向合成互補(bǔ)鏈，最終得到產(chǎn)物。而16S rRNA的PCR技術(shù)則是擴(kuò)增糞便內(nèi)的細(xì)菌rDNA，得到多個(gè)長度一致的16S rDNA片段，然后對(duì)這些片段進(jìn)行分析測序[2]。但是由于此法利用了隨機(jī)引物，在PCR的擴(kuò)增過程中容易發(fā)生交叉而造成假陽性，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2 變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳 變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis， DGGE)是一個(gè)檢測DNA突變的電泳系統(tǒng)，由Fisher等發(fā)明。該技術(shù)利用特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生的變化，將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis， TGGE)是繼DGGE之后發(fā)展起來的一個(gè)DNA指紋圖譜技術(shù)，與DGGE不同的是其電泳凝膠采用的不是尿素和甲酰胺濃度梯度，而是溫度梯度。該方法利用不同構(gòu)象的核酸分子具有不同的變性溫度(Tm)進(jìn)行分析，但與DGGE一樣，相同DNA片段之間的單堿基對(duì)取代可以導(dǎo)致熔融行為的改變，且只能在一個(gè)位點(diǎn)內(nèi)的一個(gè)小的DNA區(qū)域內(nèi)檢測到序列變異。此外，DGGE與TGGE都使用毒性凝膠，因此該技術(shù)應(yīng)用范圍相對(duì)較小。

1.3 熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)(realtime fluorescence quantitative PCR， RTFQ-PCR) RTFQ-PCR技術(shù)也稱實(shí)時(shí)PCR(Real-Time PCR)或定量PCR(Q-PCR)，是一種核酸定量技術(shù)，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針,利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)具有實(shí)時(shí)監(jiān)測、快速、靈敏、精確等特點(diǎn)[3， 4]。但是由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會(huì)影響定量的精確性。因此，其單獨(dú)使用而得到的結(jié)果是不充分、不全面的，需要結(jié)合其他技術(shù)加以輔助。

1.4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(single-strand conformation polymorphism， SSCP)是一種基于DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的方法。相同長度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。在制定最佳的SSCP方法時(shí)應(yīng)該考慮PCR片段的長度和凝膠運(yùn)行的溫度，且凝膠濃度不合適時(shí)會(huì)出現(xiàn)很多雜帶，會(huì)給基因型的判定造成一定的困難。

2 ERIC-PCR分子雜交技術(shù)

隨著人們對(duì)基因序列認(rèn)識(shí)的深入，Sharples等[5]于1990年發(fā)現(xiàn)了“基因間重復(fù)單位”，此序列重復(fù)單位主要存在于大腸桿菌中，因此被稱為腸桿菌基因間重復(fù)序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus， ERIC)，利用此序列設(shè)計(jì)引物就派生出了ERIC-PCR技術(shù)。ERIC-PCR是在隨機(jī)引物PCR(RAPD)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行指紋圖譜分析的一種方法。該技術(shù)存在很多問題，如引物太短、退火溫度過低、不易獲得穩(wěn)定的圖譜等。

3 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)是一種不依賴PCR的分子雜交技術(shù)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過特殊手段使帶有熒光物質(zhì)的探針與目標(biāo)DNA接合，最后用熒光顯微鏡即可直接觀察目標(biāo)DNA所在的位置[6]。熒光原位雜交技術(shù)可以用于腸道菌群的檢測，但由于存在樣品自身會(huì)產(chǎn)生熒光、rRNA含量低、探針特異性不足等因素導(dǎo)致的熒光信號(hào)消退等現(xiàn)象，且該方法只能針對(duì)已知的目標(biāo)基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，因此在使用時(shí)通常需要結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析。

4 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱為DNA微陣列，是一種在分子雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)主要是采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將DNA探針形成DNA微陣列，然后與樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中的靶分子的數(shù)量[7]。該方法是一種能夠同時(shí)檢測多種細(xì)菌的分析方法，具有高通量、自動(dòng)化、快速檢測等特點(diǎn)。但仍然存在許多難以解決的問題，如成本高昂、復(fù)雜、檢測靈敏度低、重復(fù)性差、分析范圍狹窄等問題[7， 8]。

5 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，一次能對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定。目前比較常見的測序平臺(tái)就是Illumina Miseq高通量測序平臺(tái)。Chen等[9]利用Illumina高通量測序技術(shù)比較研究了腸易激綜合征(IBS)患者與健康供體的微生物群落差異，在IBS患者的腸道菌群中發(fā)現(xiàn)15個(gè)屬呈現(xiàn)顯著差異，并且6個(gè)屬在IBS組和正常組的小鼠糞便標(biāo)本之間顯示出顯著不同的豐度。Hai-Bing等[10]利用該技術(shù)對(duì)冠心病患者和健康人16S rDNA的V3-V5區(qū)進(jìn)行測序，結(jié)果表明冠心病患者腸道致病菌數(shù)量高于健康人，并且R值也偏高。高通量測序技術(shù)日益成熟，其中Illumina高通量測序技術(shù)是一種新型的測序技術(shù)，也是目前較多應(yīng)用于腸道微生物研究的前沿技術(shù)。

6 結(jié)語

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)之中，解決了形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法繁瑣、復(fù)雜的問題。PCR技術(shù)多用于腸道菌群研究中，并發(fā)展出rRNA/DNA-PCR序列分析、ERIC-PCR、 PCR-DGGE等分子技術(shù)，這些技術(shù)都可以揭示腸道微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。尤其是基于16S rRNA的分子生物學(xué)技術(shù)為腸道菌群的研究帶來了第二春。但分子生物學(xué)技術(shù)自身也有很多的缺陷，因此應(yīng)結(jié)合不同的檢測技術(shù)進(jìn)行腸道菌群的測定。