閆喜惠，郭鵬，楊挺，孫冬旋

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林吉林132000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，大多數(shù)患者均存在不同程度的腎臟受累，50%～60%的患者可出現(xiàn)狼瘡性腎炎(LN)，其嚴(yán)重程度直接影響SLE的預(yù)后[1,2]。既往研究認(rèn)為，LN所致蛋白尿與血尿是由毛細(xì)血管內(nèi)增生及免疫復(fù)合物沉積引起的濾過(guò)屏障破壞的結(jié)果，但最近越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，部分LN患者可伴有以足突融合、足突寬度增加為主要表現(xiàn)的足細(xì)胞損傷，足細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)異常在LN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。足突蛋白(Podocin)、腎病蛋白(Nephrin)均為新近發(fā)現(xiàn)的足細(xì)胞裂孔膜蛋白組分，與腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能密切相關(guān)，研究證實(shí)二者表達(dá)異常是導(dǎo)致腎臟疾病蛋白尿形成的主要因素，但其在LN發(fā)病中的作用尚不明確[4]。2016年1月～2017年12月，我們觀察并分析了LN患者腎組織Podocin和Nephrin蛋白的表達(dá)變化，探討其與足細(xì)胞損傷的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院腎病風(fēng)濕科門(mén)診就診的LN患者62例作為L(zhǎng)N組，男24例、女38例，年齡19～55(35.8±5.7)歲，病程5個(gè)月～9.1年、平均3.1年，根據(jù)內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)評(píng)價(jià)腎功能損害程度[5]，將LN組分為輕度損傷27例(Ccr為51～70 mL/min)、中度損傷19例(Ccr為31～50 mL/min)、重度損傷16例(Ccr<30 mL/min)。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)制定的LN診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)臨床、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及腎活檢病理確診；排除腎小球腎炎、IgA腎病等其他腎臟疾?。慌懦[瘤、感染及心、肺、肝等系統(tǒng)嚴(yán)重功能障礙。選擇確診為SLE且無(wú)腎臟損害者60例作為SLE組，男23例、女27例，年齡21～50(35.2±4.8)歲，病程4個(gè)月～8.7年、平均3.3年。選擇同期在本院健康體檢者60例作為對(duì)照組，男30例、女30例，年齡18～50(34.4±4.6)歲。各組性別、年齡等基本資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 足細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)方法

1.2.1 各組24 h尿蛋白定量檢測(cè) 留取各組24 h尿液，采用改良雙縮脲法檢測(cè)24 h尿蛋白定量，儀器為貝克曼AU580全自動(dòng)生化分析儀。

1.2.2 各組尿足細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 留取各組清晨中段尿液25 mL，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清，取沉渣加入0.1 mL生理鹽水充分混勻。利用熒光顯微鏡，先在低倍鏡下觀察全片，再切換至高倍鏡下，選擇左上、左下、右上、右下和中間5個(gè)不同部位20個(gè)高倍視野(HP)確認(rèn)足細(xì)胞并攝像，記錄形態(tài)完整的足細(xì)胞數(shù)量。

1.3 各組尿Podocin、Nephrin 排泄?jié)舛葴y(cè)定 留取各組清晨中段尿液25 mL，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清，將尿沉渣置于計(jì)數(shù)板，干燥后用4%甲醛固定15 min。采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定尿Podocin和Nephrin排泄?jié)舛龋噭┖匈?gòu)自美國(guó)Biosource公司，根據(jù)標(biāo)本OD值計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。

1.4 LN組腎組織足細(xì)胞Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)檢測(cè) LN組在超聲引導(dǎo)下實(shí)施腎穿刺活檢術(shù)，采用免疫組化法檢測(cè)腎組織足細(xì)胞Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)。腎臟組織常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，10%正常羊血清封閉10 min，經(jīng)PBS充分洗滌后加入羊抗人Podocin、Nephrin多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS洗滌后滴加FITC標(biāo)記的驢抗羊多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，37 ℃避光水浴1 h。封片后在熒光顯微鏡下觀察，通過(guò)雙通道熒光集成圖像觀察腎組織中足細(xì)胞Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組24 h尿蛋白定量、尿足細(xì)胞數(shù)量及尿Podocin、Nephrin排泄?jié)舛缺容^ 與SLE組、對(duì)照組比較，LN組24 h尿蛋白定量、尿足細(xì)胞數(shù)量、尿Podocin及Nephrin排泄?jié)舛染?P均<0.05)；SLE組上述指標(biāo)均高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量、尿足細(xì)胞數(shù)量及尿Podocin、Nephrin排泄?jié)舛缺容^

2.2 LN組不同腎功能損害程度患者腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)比較 腎功能損害程度較重者腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)均較低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 LN組不同腎功能損害程度患者Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)比較

2.3 LN患者24 h尿蛋白量與足細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性 LN患者24 h尿蛋白量與尿Podocin排泄?jié)舛?r=0.433)、尿Nephrin排泄?jié)舛?r=0.407)均呈正相關(guān)，而與腎組織Podocin蛋白(r=-0.501)、Nephrin蛋白(r=-0.497)表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。

2.4 LN患者尿Podocin、Nephrin排泄?jié)舛扰c腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)的相關(guān)性 LN患者尿Podocin排泄?jié)舛扰c腎組織Podocin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，尿Nephrin排泄?jié)舛扰c腎組織Nephrin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.463、-0.502，P均<0.05)。

3 討論

SLE腎臟受累是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。LN的臨床表現(xiàn)多樣，從無(wú)癥狀血尿或蛋白尿至管型尿，甚至慢性腎衰竭，上述變化與腎臟病理?yè)p傷的多樣性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷及足細(xì)胞相關(guān)分子的異常表達(dá)直接影響LN的發(fā)病及病情發(fā)展[6]。足細(xì)胞是一種從細(xì)胞體延伸出突起的高度分化的細(xì)胞，位于腎小球毛細(xì)血管外側(cè)，相鄰的足細(xì)胞突起彼此交錯(cuò)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)覆蓋于腎小球毛細(xì)血管壁，在尿液形成時(shí)防止蛋白的滲漏方面起了重要的作用[7]。足細(xì)胞的損傷與蛋白尿的產(chǎn)生互為因果、相互影響，狼瘡足細(xì)胞病是近年來(lái)才逐漸被認(rèn)識(shí)的一種特殊類(lèi)型的LN[8]。LN早期初始階段足細(xì)胞數(shù)目通常是正常的，白蛋白排泄量也在正常范圍，但隨著微量白蛋白的出現(xiàn)，足細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，并合并結(jié)構(gòu)功能改變，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，導(dǎo)致蛋白尿的排泄量增加，而大量蛋白尿又進(jìn)一步加重足細(xì)胞損傷，構(gòu)成惡性循環(huán)[9]。

Podocin、Nephrin均是足細(xì)胞相關(guān)蛋白，前者屬于跨膜蛋白，特異性表達(dá)于裂孔隔膜上，后者屬于完整膜蛋白，定位于足突裂孔膜伸入足突膜的位置。近期研究表明，足細(xì)胞Podocin、Nephrin蛋白分子共同形成裂孔隔膜復(fù)合體，連接足突形成裂孔隔膜，被視為腎小球大分子蛋白濾過(guò)的最后屏障[10,11]。最近Szeto等[13]研究顯示，在活動(dòng)性LN患者尿液中Podocin mRNA及Nephrin mRNA表達(dá)明顯升高，且與24 h尿蛋白定量及狼瘡活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)，尿液中Podocin mRNA的表達(dá)增強(qiáng)亦與狼瘡活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)，但目前關(guān)于腎組織中Podocin、Nephrin的表達(dá)變化研究仍較少。本研究結(jié)果顯示，與SLE組、對(duì)照組比較，LN組24 h尿蛋白定量、尿足細(xì)胞數(shù)量、尿Podocin及Nephrin排泄?jié)舛染撸砻鱈N患者腎臟足細(xì)胞損傷與蛋白尿較重，檢測(cè)尿足細(xì)胞有助于了解腎臟功能狀態(tài)及疾病進(jìn)展[12]；24 h尿蛋白量與尿Podocin排泄?jié)舛?、尿Nephrin排泄?jié)舛染收嚓P(guān)，而與腎組織Podocin蛋白、Nephrin蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，提示尿Podocin、Nephrin排泄?jié)舛瓤勺鳛樽慵?xì)胞損傷和衡量尿蛋白的指標(biāo)。

Sun等[14]研究顯示，LN疾病早期足突與裂孔膜尚未被破壞的情況下，Nephrin表達(dá)就已開(kāi)始減少，由此推測(cè)Nephrin蛋白丟失早于裂孔膜結(jié)構(gòu)的改變。本研究結(jié)果顯示，腎功能損害程度較重者腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)均較低，提示隨著LN腎功能損傷程度的增加，更多損傷的足細(xì)胞與基底膜分離，脫落進(jìn)入尿液，導(dǎo)致腎臟Podocin、Nephrin蛋白的表達(dá)量依次降低，表明腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)情況有助于反映腎臟的微小病理改變。本研究結(jié)果顯示，尿Podocin排泄?jié)舛扰c腎組織Podocin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，尿Nephrin排泄?jié)舛扰c腎組織Nephrin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明尿、腎臟足細(xì)胞Podocin、Nephrin具有良好的相關(guān)性，尿Podocin、Nephrin排泄?jié)舛瓤勺鳛長(zhǎng)N患者足細(xì)胞損傷的無(wú)創(chuàng)傷性評(píng)估指標(biāo)。

綜上所述，LN患者尿Podocin、Nephrin排泄?jié)舛让黠@升高，而腎組織Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)明顯降低，且均與24 h尿蛋白定量密切相關(guān)，可反映足細(xì)胞的損傷程度。進(jìn)一步深入研究Podocin、Nephrin的表達(dá)在LN蛋白尿中的作用機(jī)制，有望為L(zhǎng)N探尋新的治療靶點(diǎn)。