倪洪崗，楊娟，李莉，陳永華，黃曉芳

(貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，貴陽550003)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是常見的糖尿病三大并發(fā)癥之一，發(fā)病原因尚未闡明，目前尚無特異的治療方法[1]。研究發(fā)現(xiàn)，高糖狀況可引起細胞及組織發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧簇(ROS)生成量增多，而過多的ROS生成可引起DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的損傷，也可激活下游的凋亡蛋白引起細胞凋亡[2,3]。因此，降低ROS及細胞凋亡對于DPN的治療具有重要意義。中藥在治療DPN上有一定的優(yōu)勢。糖痹康是在傳統(tǒng)經(jīng)方黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代研究成果和臨床經(jīng)驗創(chuàng)制的中藥新藥。研究顯示，糖痹康可通過提高超氧化物歧化酶(SOD)、清除過多的丙二醛(MDA)及ROS，緩解DPN的氧化應(yīng)激損傷，減少神經(jīng)細胞凋亡，從而延緩DPN進展。2017年3月～2018年8月，我們通過制備糖尿病大鼠模型，觀察糖痹康對大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織氧化應(yīng)激、細胞凋亡的影響，并探討其機制是否與p38絲裂原活性蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 選取8～9周的SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量220～260 g，購自貴州省實驗動物工程技術(shù)中心。糖痹康(主藥為黃芪、桂枝、黃芩、女貞子、黃連、水蛭、赤芍等)由北京中醫(yī)藥大學中藥學院提供。彌可保購自衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司(國藥準字H20030812)；ROS試劑盒購自南京建成生物工程研究所；B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、p38、p-p38抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自Thermo公司；TUNEL細胞凋亡試劑盒購自Roche公司；泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自Bio-Rad公司。

1.2 動物分組及模型制備 大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，隨機分為正常對照組、模型組、糖痹康低劑量組、糖痹康中劑量組、糖痹康高劑量組及彌可保組，每組各10只。造模前12 h禁止采食，模型組、糖痹康低劑量組、糖痹康中劑量組、糖痹康高劑量組及彌可保組腹腔注射0.45%的鏈脲佐菌素(STZ)溶液60 mg/kg制備糖尿病模型，72 h后用血糖儀檢測尾尖血，血糖水平≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功。正常對照組腹腔注射等量注射枸櫞酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，60 mg/kg，pH 4.5)。

1.3 干預(yù)方法 造模成功后，待血糖平穩(wěn)3 d開始灌胃給藥，糖痹康低劑量組、糖痹康中劑量組、糖痹康高劑量組分別按成人劑量的5、10、20倍，灌胃糖痹康4.17、8.35、16.70 g/(kg·d)，彌可保組按成人劑量的10倍灌胃彌可保1.97 g/(kg·d)，連續(xù)給藥8周，自由飲水、采食。為了預(yù)防因血糖水平過高導(dǎo)致大鼠不能存活至實驗結(jié)束，大鼠皮下注射1～4 IU/d的精蛋白鋅胰島素注射液，使血糖水平維持在20.0～25.0 mmol/L。

1.4 背根神經(jīng)節(jié)取材 給藥8周后，將各組大鼠腹腔注射12%烏拉坦(10 mg/kg)進行麻醉，股部剪毛消毒，以仰臥位在手術(shù)臺上固定，找到膨大的背根神經(jīng)節(jié)，切除神經(jīng)組織，置于凍存管中-80 ℃保存。

1.5 神經(jīng)組織ROS水平檢測 取給藥8周后的神經(jīng)組織，按照ROS試劑盒操作說明檢測ROS水平。

1.6 神經(jīng)組織細胞凋亡檢測 按照TUNEL試劑盒的說明書進行操作。光鏡下進行陽性細胞判斷，計數(shù)及分析。光鏡下凋亡細胞的表現(xiàn)為細胞核呈棕褐色，染色質(zhì)分布不均，染色深淺大小不一，核周有空暈。凋亡率=(實驗組陽性細胞數(shù)/對照組陽性細胞數(shù))×100%。

1.7 神經(jīng)組織Bcl-2、Cleaved Caspase3、p38、p-p38蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Cleaved Caspase3以及p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白p38、p-p38的表達。提取神經(jīng)組織總蛋白，BCA法檢測總蛋白的濃度，蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，100 ℃煮沸變性5 min，每孔取50 μg總蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入1∶500稀釋的Bcl-2、Cleaved Caspase3、p38、p-p38及1∶1 000稀釋的GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜，加入1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗，37 ℃震蕩60 min，洗膜，增強型化學法(ECL)檢測蛋白質(zhì)印跡，顯影、定影后晾干保存。Quantity One軟件分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白GAPDH的蛋白信號條帶灰度值，Image J軟件對蛋白信號值進行具體的量化。以目的蛋白與GAPDH灰度值比值為各蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)組織ROS水平比較 模型組ROS水平高于正常對照組(P<0.05)；糖痹康低、中、高劑量組及彌可保組ROS水平均低于模型組(P均<0.05)；糖痹康高劑量組ROS水平低于糖痹康中劑量組，糖痹康中劑量組ROS水平低于糖痹康低劑量組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組神經(jīng)組織細胞凋亡比較 模型組細胞凋亡率高于正常對照組(P<0.05)；糖痹康低、中、高劑量組及彌可保組細胞凋亡率均低于模型組(P均<0.05)；糖痹康高劑量組細胞凋亡率低于糖痹康中劑量組，糖痹康中劑量組細胞凋亡率低于糖痹康低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)組織ROS水平、細胞凋亡率比較

2.3 各組神經(jīng)組織Bcl-2、Cleaved Caspase3蛋白表達比較 模型組Bcl-2蛋白表達低于正常對照組(P<0.05)，Cleaved Caspase3蛋白表達高于正常對照組(P<0.05)；與模型組比較，糖痹康低、中、高劑量組及彌可保組Bcl-2蛋白表達均升高，Cleaved Caspase3蛋白表達均降低(P均<0.05)；糖痹康高劑量組Bcl-2蛋白表達高于糖痹康中劑量組，糖痹康中劑量組Bcl-2蛋白表達高于糖痹康低劑量組；糖痹康高劑量組Cleaved Caspase3蛋白表達低于糖痹康中劑量組，糖痹康中劑量組Cleaved Caspase3蛋白表達低于糖痹康低劑量組(P均<0.05)。見表2、圖1。

注：1為正常對照組；2為模型組；3為糖痹康低劑量組；4為糖痹康中劑量組；5為糖痹康高劑量組；6為彌可保組。

2.4 各組神經(jīng)組織p38、p-p38蛋白表達比較 模型組p38、p-p38蛋白表達均高于正常對照組(P均<0.05)；與模型組比較，糖痹康低、中、高劑量組及彌可保組p38、p-p38蛋白表達均降低(P均<0.05)；糖痹康高劑量組p38、p-p38蛋白表達低于糖痹康中劑量組，糖痹康中劑量組p38、p-p38蛋白表達低于糖痹康低劑量組(P均<0.05)。見表2、圖2。

注：1為正常對照組；2為模型組；3為糖痹康低劑量組；4為糖痹康中劑量組；5為糖痹康高劑量組；6為彌可保組。

表2 各組神經(jīng)組織Bcl-2、Cleaved Caspase3、p38、p-p38蛋白表達比較

3 討論

目前認為，在慢性高糖基礎(chǔ)上，氧化應(yīng)激、微血管病變、脂肪代謝異常等多種因素可通過直接或間接的作用于神經(jīng)組織，引起DPN[5]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)中過氧化物、H2O2、O2-等水平增多，而氧化應(yīng)激是DPN發(fā)生及進展中引起多條代謝通路受損的最后結(jié)果[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，糖痹康可改善DPN大鼠脛神經(jīng)節(jié)的傳導(dǎo)速度，降低血清內(nèi)皮素(ET)水平，上調(diào)血清一氧化氮(NO)水平[8]；可通過清除機體ROS、MDA的過度堆積，緩解DPN的氧化應(yīng)激損傷，從而延緩DPN的進展[9]。糖痹康對DPN具有抗氧化作用，可通過減輕氧化應(yīng)激造成的周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而對DPN有較好的神經(jīng)保護作用[10]。糖痹康可以抑制Drp-1的表達水平，促進抗凋亡基因Bcl-2的表達而抑制促凋亡基因Bax表達，從而具有抗Drp-1信號通路的細胞凋亡作用，緩解DPN的進展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖痹康低、中、高劑量組ROS水平均低于模型組，糖痹康高劑量組細胞凋亡率低于糖痹康中劑量組，糖痹康中劑量組細胞凋亡率低于糖痹康低劑量組，提示糖痹康降低DPN細胞凋亡機制可能與降低ROS水平、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

細胞凋亡是由基因控制的一種程序性死亡過程，受到Caspase家族和Bcl-2家族的調(diào)控。Caspase是凋亡的主要執(zhí)行者，Caspase3是該家族的關(guān)鍵酶，在受到凋亡刺激后被激活，活化后將使凋亡進入不可逆階段[12,13]。Bcl-2家族有促進凋亡蛋白和抑凋亡蛋白組成，Bcl-2是抑凋亡蛋白，也是該家族中最先被認識的，其表達降低可促進細胞的凋亡[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在熱痛覺過敏引起的DPN大鼠脊髓組織中可發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2及Caspase3水平升高[15]；中藥筋脈痛可通過提高DPN大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中抗凋亡基因Bcl-2的表達水平，抑制促凋亡基因Caspase3的表達水平，從而使細胞凋亡率降低[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖痹康低、中、高劑量組及彌可保組細胞凋亡率均低于模型組，提示糖痹康可通過降低PDN細胞凋亡而對其損傷起保護作用；與模型組比較，糖痹康低、中、高劑量組及彌可保組Bcl-2蛋白表達均升高，Cleaved Caspase3蛋白表達均降低，細胞凋亡率降低，提示糖痹康對DPN凋亡影響可能與調(diào)節(jié)Bcl-2家族及Caspase家族相關(guān)蛋白表達的有關(guān)。

MAPK是一個高度保守的信號途徑，p38 MAPK是該家族中重要的一員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因表達及細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用[17,18]。有研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK信號通路在周圍神經(jīng)損傷后被激活[19]；p38 MAPK的抑制劑對實驗神經(jīng)損傷、興奮性毒性等治療方面已取得了潛在的益處。本研究發(fā)現(xiàn)，糖痹康低、中、高劑量組及彌可保組p38、p-p38蛋白表達均低于模型組，提示糖痹康可通過抑制p38 MAPK信號通路影響DPN的進展。

綜上所述，糖痹康可降低糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織ROS水平、抑制細胞凋亡，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Cleaved Caspase3蛋白表達，其機制可能與抑制p38 MAPK信號通路有關(guān)，但具體作用機制還需進一步證實。