何磊，張清秀，魏秀娥，高紅，宋加興，榮良群

(徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇徐州221006)

缺血性腦卒中是腦血管病最常見(jiàn)的類(lèi)型，炎癥反應(yīng)是其損傷的主要機(jī)制之一[1,2]。腦缺血后的再灌注損傷可使血腦屏障中緊密連接蛋白(ZO-1)等多種連接蛋白減少，屏障通透性增加及完整性破壞，而產(chǎn)生腦水腫[3]。研究表明，腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的增加與血腦屏障通透性的改變密切相關(guān)[4]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號(hào)通路可介導(dǎo)缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及分化[5]。p38的激活可使炎性細(xì)胞因子表達(dá)增高[6]。研究表明，干擾p38 MAPK信號(hào)通路可降低缺血組織的損傷程度。益母草堿(LEO)是一種活性生物堿，具有多種生物學(xué)功能，對(duì)心腦血管疾病有保護(hù)性作用[7]。2017年10月～2018年3月，本研究通過(guò)建立小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型模擬腦缺血再灌注損傷，探討LEO對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的影響，探討其是否通過(guò)抑制p38 MAPK激活、減少炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料 普通級(jí)健康雄性昆明小鼠120只，體質(zhì)量20～24 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。佳靈線(xiàn)栓購(gòu)于廣州佳靈生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇及甲醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LEO、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、伊文思藍(lán)和N,N-二甲基甲酰胺均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；蘇木素-伊紅染料購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司；p38、p-p38單克隆抗體均購(gòu)于CST公司；ZO-1多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；IL-1β、IL-6、TNF-α引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(KR104)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 小鼠分組與大腦中動(dòng)脈栓塞模型建立 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、LEO組3組，每組40只。模型組、LEO組按參考文獻(xiàn)[8]制備小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型。用4%水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，固定并消毒頸部皮膚，做正中切口，暴露頸部組織，鈍性分離小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈和頸外處打活結(jié)，在頸外動(dòng)脈上距分叉不遠(yuǎn)處剪一小口插入線(xiàn)栓送入頸內(nèi)動(dòng)脈，至有阻力時(shí)停止，活結(jié)固定，線(xiàn)栓阻塞90 min后拔出，形成缺血再灌注損傷。假手術(shù)組除不插入線(xiàn)栓外，其余操作同模型組。

1.3 LEO給藥方法 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高劑量LEO的腦保護(hù)作用更明顯，故選擇高劑量LEO[15 mg/(kg·d)]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。造模后30 min，LEO組腹腔注射LEO溶液15 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 腦梗死體積測(cè)量 采用TTC染色法。小鼠造模后24 h，每組隨機(jī)取5只，斷頭取腦，切掉嗅球和小腦，隨后將腦組織冠狀切成5等份[9]，每片厚度為2～3 mm，放入2%的TTC溶液中，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，將腦切片放于4%多聚甲醛過(guò)夜固定。用Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)定腦梗死體積。圖片紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，白色區(qū)域?yàn)槿毖Ｋ啦课?。?jì)算腦梗死體積：梗死體積比=梗死體積/全腦體積×100%，梗死體積=各切面梗死面積之和×厚度，全腦體積=各切面總面積×厚度。

1.5 腦水腫程度測(cè)定 參照文獻(xiàn)[10]方法操作。造模24 h后，每組取5只小鼠斷頭取腦，切除嗅球和小腦，將腦組織放入105 ℃烘箱24 h，后取出稱(chēng)量干重，測(cè)腦含水量以評(píng)價(jià)腦水腫程度，腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 血腦屏障通透性測(cè)定 采用伊文思藍(lán)(EB)法[11]。造模21 h后，尾靜脈注射2%EB(4 mL/kg，生理鹽水配制)，體內(nèi)循環(huán)3 h后麻醉，用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注至流出清亮液體，之后斷頭取腦，拍照。切除梗死側(cè)半球稱(chēng)量濕重后，放入3 mL甲酰胺中萃取，60 ℃水浴鍋孵育24 h，取出后離心取上清液，加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及各樣本吸光度，計(jì)算腦組織EB含量。

1.7 腦組織形態(tài)觀察 采用HE染色法。小鼠造模24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，后用生理鹽水灌注，再用4%多聚甲醛灌注以固定腦組織，剝離鼠腦放入4%多聚甲醛中過(guò)夜以再次固定，取出后再用各濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋及切片。用HE染料進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)元病理變化。

1.8 腦組織p-p38及ZO-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。造模24 h后，斷頭取腦切取缺血側(cè)大腦皮層，提取腦組織中總蛋白，分別檢測(cè)p-p38和ZO-1。BCA法進(jìn)行蛋白定量，用酶標(biāo)儀測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及各樣本濃度，計(jì)算并調(diào)整濃度使一致。上樣，待電泳后轉(zhuǎn)膜 (PVDF膜)，室溫放于脫色搖床封閉4～6 h。隨后加入相應(yīng)的抗體稀釋液，4 ℃搖床過(guò)夜后取出，室溫靜置30 min，洗膜并用對(duì)應(yīng)的二抗孵育1.5 h，洗膜并曝光拍照。用Image J軟件進(jìn)行圖片分析。

1.9 腦組織炎性因子表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法檢測(cè)腦組織炎性因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)。TRIzol法提取腦缺血側(cè)總RNA，按照天根公司的TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(KR104)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。GAPDH正義鏈5′-CAACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，反義鏈5′-ACACATTGGGGGTAGGAACAC-3′；IL-1β正義鏈5′-CCAGGGCATGTTAAGGAGCT-3′，反義鏈5′-CCATCAGAGGCAAGGAGG AA-3′；IL-6正義鏈5′-GCTGGTGACAACCACGGCCT-3′，反義鏈5′-AGCCTCCGACTTGTGAAGTGGT-3′；TNF-α正義鏈5′-TCCTGGCCAACGGCATGGAT-3′，反義鏈5′-AATCGGCTGACGGTGTGGGT-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組腦梗死體積比、腦含水量、血腦屏障通透性比較 模型組腦梗死體積比、腦含水量、EB含量均高于假手術(shù)組，LEO組腦梗死體積比、腦含水量、EB含量均低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組腦梗死體積比、腦含水量及EB含量比較

2.2 各組大腦皮層及海馬神經(jīng)元損傷情況比較 與假手術(shù)組相比，模型組皮層及海馬大片神經(jīng)元間疏松水腫，細(xì)胞核固縮未見(jiàn)有清晰核仁、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等缺血缺氧壞死的病理改變。與模型組相比，LEO組損傷神經(jīng)元細(xì)胞顯著減少，胞核較為清晰，形態(tài)正常的神經(jīng)元增多。

2.3 各組p-p38和ZO-1蛋白表達(dá)比較 模型組p-p38蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組、ZO-1蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組，LEO組p-p38蛋白表達(dá)低于模型組、ZO-1蛋白表達(dá)高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

注：A為p-p38蛋白表達(dá)，B為ZO-1蛋白表達(dá)。

2.4 各組皮層炎癥介質(zhì)表達(dá)比較 模型組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組，LEO組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組p-p38、ZO-1蛋白及IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)比較

3 討論

小鼠腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制為多因素，包括炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞等[1]。在腦受到應(yīng)激后，炎癥反應(yīng)迅速發(fā)生促使炎細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)的釋放，再灌注后中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等被激活，產(chǎn)生大量IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)[12,13]。此外，血腦屏障的破壞與腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制也有著密切的關(guān)系。血腦屏障由血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞組成。內(nèi)皮細(xì)胞間存在大量緊密連接，ZO-1是維持大腦微血管內(nèi)皮完整性的主要結(jié)構(gòu)和功能分子[14]。腦卒中后，炎癥反應(yīng)使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生毒性反應(yīng)導(dǎo)致血管完整性的改變，使屏障發(fā)生滲漏[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腦梗死體積比、腦含水量及EB含量均高于假手術(shù)組，提示腦缺血再灌注后小鼠腦梗死體積及腦水腫程度加重、血腦屏障通透性增加、大腦皮層及海馬神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p傷，可見(jiàn)，缺血對(duì)腦組織產(chǎn)生的損害極為嚴(yán)重。

p38 MAPK在正常組織中幾乎不表達(dá)，但在細(xì)胞應(yīng)激如凋亡刺激和炎性損傷時(shí)則被激活。研究表明，p38 MAPK已經(jīng)被確認(rèn)為抑炎藥物的目標(biāo)蛋白，在炎性因子mRNA的翻譯和穩(wěn)定性方面都起著重要的作用[16]。在小鼠腦缺血再灌注后，腦內(nèi)固有的細(xì)胞及外周免疫細(xì)胞都被大量激活，使炎癥因子表達(dá)升高，同時(shí)p38信號(hào)通路也在此過(guò)程中活化，p-p38在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)增多，進(jìn)一步促進(jìn)了炎癥介質(zhì)的釋放，使?jié)B入血腦屏障中的毒性物質(zhì)增多而參與血腦屏障的破壞[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組的p-p38蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，而ZO-1蛋白的表達(dá)則低于假手術(shù)組，表明p38 MAPK信號(hào)通路可能參與了腦缺血再灌注損傷所致的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，缺血再灌注后，機(jī)體通過(guò)上調(diào)p-p38和炎癥因子的表達(dá)，使腦水腫程度增大，細(xì)胞壞死凋亡進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障發(fā)生滲漏，完整性破壞。

益母草為益母草屬植物，其主要成分為L(zhǎng)EO，許多研究證明LEO具有溶栓、改善微循環(huán)、抗氧自由基、減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載等諸多作用，已被廣泛用于缺血性心腦血管病的治療[18]。研究顯示，LEO可顯著抑制BV-2細(xì)胞中炎性蛋白的表達(dá)，可減輕炎癥反應(yīng)，減少血腦屏障的損傷，主要是通過(guò)抑制c-Jun N末端激酶(JNK)信號(hào)通路[19]。在急性腎損傷中，LEO能改善腎功能，顯著抑制 TNF-α、IL-1、IL-6 等炎癥因子表達(dá)，使腎臟損傷減輕[20]；此外，它也能減輕大鼠急性?xún)?nèi)毒素性葡萄膜炎模型的炎癥反應(yīng)，可見(jiàn)，LEO可通過(guò)減輕機(jī)體損傷后的炎癥反應(yīng)，而發(fā)揮其保護(hù)作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，LEO組梗死體積比、腦含水量、EB含量均低于模型組，提示予LEO治療后，與模型組相比，小鼠腦梗死體積減少，腦水腫程度下降；LEO組與模型組相比，損傷神經(jīng)元減少，胞核較為清晰，形態(tài)正常的神經(jīng)元數(shù)增多，且LEO組腦組織ZO-1蛋白表達(dá)也增加，提示LEO可顯著改善血腦屏障的完整性，使神經(jīng)元細(xì)胞損傷有所恢復(fù)；LEO組腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均低于模型組，提示LEO可抑制腦組織炎癥反應(yīng)，可能與其改善腦組織缺血再灌注損傷有關(guān)。