周儀華，袁影，盛志勇，王舒，王萌，郭良云

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006)

膿毒癥性心肌損傷是膿毒癥休克難以糾正、甚至導(dǎo)致患者最終死亡的重要原因。血紅素加氧酶-1(HO-1)也稱熱休克蛋白32(HSP32)，是血紅素降解過(guò)程中的限速酶和關(guān)鍵酶，可在多種生物中表達(dá)。研究表明，HO-1及其催化血紅素的代謝產(chǎn)物膽綠素、一氧化碳共同組成了機(jī)體重要的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用[1]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)廣泛分布于高等真核生物細(xì)胞核中，是一類高度保守的蛋白質(zhì)，是膿毒癥晚期的炎性反應(yīng)因子，其水平與膿毒癥患者的嚴(yán)重程度具有直接的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的心臟收縮功能障礙中發(fā)揮重要作用[2]。在肺部、腸道等器官功能炎癥損傷動(dòng)物模型中，機(jī)體可通過(guò)調(diào)節(jié) HO-1及HMGB1的釋放而發(fā)揮器官功能的保護(hù)作用[3,4]。但目前，HO-1在膿毒癥心肌中的保護(hù)作用是否與HMGB1表達(dá)存在特定關(guān)系尚不清楚。2016年6月～2017年12月，我們建立了膿毒癥大鼠模型，分別給予HO-1增強(qiáng)劑CoppⅨ和抑制劑ZnppⅨ，觀察對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷的影響及HMGB1的表達(dá)變化，探討HO-1與HMGB1在膿毒癥心肌損傷發(fā)病中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 SPF級(jí)SD雄性大鼠128只，體質(zhì)量180～220 g，由南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部提供。HO-1增強(qiáng)劑CoppⅨ(Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó))，HO-1抑制劑ZnppⅨ(Sigma公司，美國(guó))，ELISA試劑盒(Amersham公司，美國(guó))。

1.2 分組及干預(yù)方法 將128只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組、CoppⅨ組、ZnppⅨ組，每組32只。CoppⅨ組和ZnppⅨ組均于造模前24 h分別給予腹腔注射HO-1增強(qiáng)劑CoppⅨ 10 mg/kg、HO-1抑制劑ZnppⅨ 10 mg/kg，假手術(shù)組和膿毒癥組不給藥。

1.3 膿毒癥模型制備 膿毒癥組、CoppⅨ組、ZnppⅨ組均通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法建立膿毒癥模型。術(shù)前禁食12 h，采用異氟烷吸入麻醉法誘導(dǎo)和維持大鼠麻醉狀態(tài)，常規(guī)消毒鋪巾，無(wú)菌狀態(tài)下用手術(shù)直剪于腹白線中點(diǎn)下方約0.3 cm處逐層剪開皮膚、肌層和腹膜，直視下探查腹腔，將盲腸末端取出并置于腹壁外，采用4號(hào)縫合線距盲腸末端1.6 cm處結(jié)扎，結(jié)扎后用3號(hào)三棱針穿刺一孔，之后分別將盲腸回納腹腔，4號(hào)縫合針逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后3 h左右自由進(jìn)食、飲水，觀察大鼠活動(dòng)、進(jìn)食、豎毛、腹瀉、眼球凹陷、呼吸等情況。假手術(shù)組無(wú)菌狀態(tài)下開腹找出盲腸后再將其還納腹腔，不做CLP術(shù)，其余操作均同其他三組。

1.4 心肌損傷指標(biāo)檢測(cè) 各組均于造模后0、6、12、24 h時(shí)處死大鼠8只，開腹經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5～6 mL，采用ELISA法檢測(cè)各組心肌損傷指標(biāo)包括血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白-I(cTnI)、B型腦鈉肽(BNP)、心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)水平，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 血清HMGB1及HO-1水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)各組造模后0、6、12、24 h時(shí)血清HMGB1及HO-1水平，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組血清心肌損傷指標(biāo)水平比較 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)血清CK-MB、cTnI、BNP差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。膿毒癥組6、12、24 h時(shí)血清CK-MB、cTnI、BNP、H-FABP水平均高于假手術(shù)組，其中CK-MB、cTnI、BNP水平以24 h時(shí)最高，H-FABP水平以6 h時(shí)最高(P均<0.05)。CoppⅨ組24 h血清CK-MB、cTnI、BNP水平均低于膿毒癥組，ZnppⅨ組6、12、24 h時(shí)血清CK-MB、cTnI、BNP水平均高于膿毒癥組(P均<0.05)。ZnppⅨ組12、24 h時(shí)血清CK-MB、cTnI、BNP水平均高于CoppⅨ組，6、12、24 h時(shí)血清H-FABP均高于CoppⅨ組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清CK-MB、cTnI、BNP、H-FABP水平變化

2.2 各組血清HMGB1、HO-1水平比較 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)血清HMGB1、HO-1差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。膿毒癥組6、12、24 h時(shí)血清HMGB1及HO-1水平均高于假手術(shù)組(P均<0.05)。6、12、24 h時(shí)，CoppⅨ組血清HMGB1水平均低于膿毒癥組、HO-1水平均高于膿毒癥組，ZnppⅨ組血清HMGB1水平均高于膿毒癥組、HO-1水平均低于CoppⅨ組(P均<0.05)。見表2。

2.3 HMGB1與HO-1的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果示，膿毒癥組、CoppⅨ組、ZnppⅨ組血清HMGB1與HO-1水平均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.342、-0.415、-0.437，P均<0.05)。

3 討論

膿毒癥最初定義為感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，目前對(duì)其定義為機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[5]。從概念中可以看出“宿主反應(yīng)”和“器官功能障礙”是SIRS的兩個(gè)核心，因而需更關(guān)注機(jī)體在應(yīng)對(duì)感染時(shí)所產(chǎn)生的復(fù)雜病理生理反應(yīng)。目前對(duì)膿毒癥產(chǎn)生的免疫和炎癥反應(yīng)所涉及的復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制了解仍不全面。與膿毒癥相關(guān)的死亡中，有50%被證實(shí)存在心肌功能障礙。因此，進(jìn)一步探討膿毒癥心肌損傷相關(guān)炎癥因子并明確其發(fā)生機(jī)制，對(duì)提高臨床上膿毒癥治療的成功率以及降低膿毒癥的病死率起重要作用。

表2 各組血清HMGB1、HO-1水平比較

本研究采用成熟穩(wěn)定的 CLP法制備膿毒癥模型，通過(guò)心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnI、BNP和H-FABP的檢測(cè)評(píng)估心肌損傷及損傷嚴(yán)重程度。其中CK-MB、cTnI和BNP是目前公認(rèn)的心肌損傷標(biāo)志物，已在臨床工作中得到廣泛應(yīng)用。CK-MB能較早期反映心肌的損傷，但其敏感性和特異度較差，對(duì)心肌微小損傷不敏感；cTnI是橫紋肌上的結(jié)構(gòu)蛋白，與膿毒癥心肌細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，是目前診斷心肌損傷的高敏感和高特異性的生化標(biāo)志物；BNP則是判斷是否存在心功能不全的常用指標(biāo)，它的含量變化可反映心室壓力和容量負(fù)荷的變化，對(duì)診斷心功能不全具有很高的特異性及較高的敏感度。CK-MB、cTnI和BNP在早期診斷及反映心肌損傷的特異性方面仍有一定局限性[6]。H-FABP則是一個(gè)相對(duì)較新的心肌損傷標(biāo)志物，主要存在于心肌細(xì)胞胞質(zhì)中，血液和其他組織中含量極低，在診斷心肌損傷方面具有較高的特異性。當(dāng)心肌受損時(shí)，參與心肌脂肪酸的攝入、運(yùn)輸和代謝的H-FABP會(huì)在心肌損傷時(shí)穿過(guò)細(xì)胞膜漏入血液中[7]。由于其分子量小，在心肌受損情況下，可迅速穿過(guò)細(xì)胞膜漏入血管內(nèi)，這在診斷心肌損傷方面具有較高的敏感性[8]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組6、12、24 h時(shí)CK-MB、cTnI、BNP以及H-FABP水平均高于假手術(shù)組，且CK-MB、cTnI和BNP 在24 h時(shí)達(dá)最高水平，而H-FABP水平在6 h達(dá)高峰，提示膿毒癥大鼠容易合并心肌損傷，且該損傷在膿毒癥早期(6 h)之內(nèi)即出現(xiàn)。

HO廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，可酶促血紅素代謝產(chǎn)生一氧化碳、膽紅素和鐵離子，在細(xì)胞增殖與凋亡、維持血管張力、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多方面起著重要的作用。HO有3種同工酶，即HO-1、HO-2和HO-3。HO-1及其酶解產(chǎn)物具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和改善微循環(huán)、促進(jìn)免疫耐受等作用。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中可以抵抗各種有害刺激導(dǎo)致的機(jī)體損傷，在膿毒癥心肌、肝臟、肺部等疾病的靶器官保護(hù)方面發(fā)揮重要作用[9～12]。HO-1可能也在嚴(yán)重膿毒癥大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的損害中發(fā)揮作用，并可能作為細(xì)胞內(nèi)一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，對(duì)減輕膿毒癥大鼠心肌損傷起著重要的保護(hù)作用。CoppⅨ和ZnppⅨ分別是HO-1的誘導(dǎo)劑和抑制劑。本研究發(fā)現(xiàn)，CoppⅨ組6、12、24 h時(shí)血清HO-1水平均高于膿毒癥組，而ZnppⅨ組6、12、24 h時(shí)血清HO-1水平均低于CoppⅨ組，提示給予HO-1增強(qiáng)劑CoPPⅨ后HO-1表達(dá)增加；相反，給予HO-1抑制劑ZnppⅨ后HO-1表達(dá)降低，表明HO-1可能在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用；CoppⅨ組24 h時(shí)血清CK-MB、cTnI、BNP水平均低于膿毒癥組，ZnppⅨ組6、12、24 h時(shí)血清CK-MB、cTnI、BNP水平均高于膿毒癥組，提示給予HO-1誘導(dǎo)劑CoppⅨ后心肌損傷程度減輕，而給予HO-1抑制劑ZnppⅨ后心肌損傷加重；ZnppⅨ組12、24 h時(shí)血清CK-MB、cTnI、BNP、H-FABP水平均高于CoppⅨ組，提示給予HO-1抑制劑ZnppⅨ抑制HO-1的表達(dá)后，膿毒癥大鼠心肌損傷加重，進(jìn)一步證實(shí)HO-1對(duì)膿毒癥損傷心肌具有保護(hù)作用。

HMGB1是一種核內(nèi)蛋白，其核內(nèi)功能主要是使雙螺旋扭曲以便各種轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)相互作用，以調(diào)節(jié)類固醇激素受體、NF-κB、p53及RAG1/2重組酶的轉(zhuǎn)錄活性。HMGB1是相對(duì)于TNF-α、IL-1等新的“晚期”炎癥因子，是膿毒癥致死效應(yīng)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)，其表達(dá)水平與膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后高度相關(guān)[13,14]。HMGB1可通過(guò)被動(dòng)釋放(壞死細(xì)胞)或主動(dòng)分泌(活化的單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)而釋出至細(xì)胞外。胞外HMGB1是一類重要的警報(bào)素，可參與多種炎性疾病(如膿毒癥、急性肺損傷、自身免疫病、同種移植排斥反應(yīng))發(fā)生和發(fā)展，在充血性心力衰竭、急性心肌梗死，心肌缺血再灌注損傷及動(dòng)脈粥樣硬化等發(fā)病過(guò)程起重要推動(dòng)作用，也參與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組6、12、24 h HMGB1水平均高于假手術(shù)組，提示膿毒癥組大鼠血清中HMGB1的表達(dá)升高，結(jié)合各時(shí)點(diǎn)心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnI、BNP和H-FABP的表達(dá)明顯升高的結(jié)果，考慮HMGB1可能加重膿毒癥的心肌損傷。

Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠ARDS模型中氫氣可以通過(guò)上調(diào)HO-1的合成，抑制HMGB1的表達(dá)，進(jìn)而改善肺組織的炎癥反應(yīng)，降低模型動(dòng)物的病死率。Yu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié) HO-1及HMGB1的釋放，可減輕膿毒癥大鼠腸功能損傷、增加存活率。Kim等[15]研究也證實(shí)，在巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中，甘草皂苷可以通過(guò)上調(diào)HO-1的合成，抑制LPS誘導(dǎo)的HMGB1的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，CoppⅨ組6、12、24 h時(shí)血清HMGB1水平均低于膿毒癥組，提示給予HO-1誘導(dǎo)劑CoppⅨ增強(qiáng)HO-1的表達(dá)后，HMGB1的表達(dá)降低；ZnppⅨ組6、12、24 h時(shí)血清HMGB1水平均高于膿毒癥組，提示給予HO-1抑制劑ZnppⅨ降低HO-1的表達(dá)后，HMGB1的表達(dá)升高；相關(guān)性分析顯示HMGB1與HO-1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示HO-1對(duì)膿毒癥損傷心肌的保護(hù)作用可能與HMGB1水平降低有關(guān)。

綜上所述，HO-1對(duì)膿毒癥大鼠的心肌具有保護(hù)作用，HO-1對(duì)心肌的保護(hù)作用可能與降低血清HMGB1水平有關(guān)。本研究為膿毒癥靶向治療提供了理論依據(jù)，對(duì)膿毒癥的臨床治療提供新的思路。