李耀輝，劉春來

(1中國醫(yī)科大學(xué)第四臨床學(xué)院，沈陽110000；2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院)

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是位居世界第6位及致死率第9位的惡性腫瘤[1]。由于膀胱癌具有復(fù)發(fā)率高、侵襲和遷移能力高等特點(diǎn)，患者的預(yù)后十分不理想[2]。微小RNA(miRNA)是一組長度為17～25個(gè)核苷酸且高度保守的非編碼小RNA分子，它們通過堿基配對的方式與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)結(jié)合后，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[3]。miRNA-212(以下簡稱miR-212)是近年發(fā)現(xiàn)的miRNA家族中的一個(gè)重要分子，大量研究表明，miR-212與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，且參與細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[4]。高遷移率族蛋白(HMGA)家族是一系列染色質(zhì)相關(guān)蛋白，其中HMGA2蛋白質(zhì)是由一個(gè)獨(dú)立的基因編碼，可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組及修復(fù)的過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA可通過調(diào)控HMGA2在喉癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮生物學(xué)作用，但在膀胱癌中miR-212是否調(diào)控HMGA2尚無相關(guān)報(bào)道。2017年1月～2018年8月，我們檢測了膀胱癌組織中miR-212 mRNA的表達(dá)，并觀察了上調(diào)miR-212表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探討miR-212是否通過調(diào)控HMGA2來實(shí)現(xiàn)其作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、組織標(biāo)本及試劑 人膀胱癌T24細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。收集2017年1月～2018年8月31例在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)的膀胱癌患者的膀胱癌病理組織標(biāo)本及配對癌旁正常組織，術(shù)中組織液氮凍存后放入-80 ℃保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；HMGA2抗體購自美國Abcam公司；TRIzol、Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司；MTT檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司；miR-212 mimics及空白對照miR-212 NC由廣州銳博生物科技有限公司提供；RT-PCR試劑盒購自上海吉瑪生物公司；SYBR Green real Time PCR試劑購自日本Takara生物有限公司。Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司。本研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 膀胱癌組織及癌旁正常組織中miR-212表達(dá)檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)。膀胱癌組織及癌旁正常組織中總RNA的提取按照TRIzol說明書進(jìn)行，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。以cDNA 為模板，用SYBR Green做熒光染料，qRT-PCR法檢測miR-212的表達(dá)。miR-212引物序列為正義鏈5′-GCCTCCTGACTCCAGGTCC-3′，反義鏈5′-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3′；U6引物序列為正義鏈5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反義鏈5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：92 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。目的基因的表達(dá)采用相對定量法，即以U6 RNA作為內(nèi)參，計(jì)算ΔCt，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-212的相對表達(dá)量。

1.3 上調(diào)miR-212表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 膀胱癌T24細(xì)胞株使用DMEM培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素細(xì)胞，于5% CO2、37 ℃的環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。每隔2～3天換液，每周傳代2次。取處于對數(shù)生長期的T24細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，換無血清的培養(yǎng)基同步化24 h，按照Lipofectamine2000說明書操作進(jìn)行。將T24細(xì)胞分為miR-212組和對照組，其中miR-212組轉(zhuǎn)染miR-212 mimics，對照組轉(zhuǎn)染空白miR-212 NC。培養(yǎng)6 h更換培養(yǎng)基為含血清細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-212組miR-212 mRNA表達(dá)較對照組升高(P<0.05)，表明miR-212 mimics轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2 膀胱癌細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法。將成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)基稀釋miR-212組細(xì)胞至150 nmol/L加入200 μL相應(yīng)培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h后，每孔加入MTT溶液孵育4 h后加入DMSO均勻振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定吸光度(A490)值。

1.3.3 膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力測定 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)均使用Corning BioCoatTMMatrigel侵襲小室，分為帶膠和不帶膠小室兩種。取對數(shù)生長期的miR-212組和對照組細(xì)胞，胰酶消化后用含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106/mL，向Transwell板的下室加入含有40%FBS的培養(yǎng)基600 μL，而向上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)約24 h。觀察膜及孔下細(xì)胞數(shù)，用甲醇浸泡固定，室溫下固定5 min后，將小室放入結(jié)晶紫溶液中染5 min。染色結(jié)束后沖洗小室，洗脫殘余結(jié)晶紫溶液。將小室底部膜的細(xì)胞用棉簽擦拭去除后，將小室晾干。最后在正置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)小室膜的細(xì)胞數(shù)量，拍照計(jì)數(shù)。

1.3.4 膀胱癌細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。miR-212組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用胰酶消化后加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，混勻后冰浴30 min進(jìn)行超聲勻漿并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白的含量。用濕轉(zhuǎn)法將樣品蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入相應(yīng)一抗1∶1 000稀釋抗HMGA2抗體，放置于4 ℃孵育過夜。GAPDH為內(nèi)參對照。加入相應(yīng)羊抗鼠二抗孵育1 h，TBST液充分洗膜并顯影。

1.4 miR-212與HMGA2的結(jié)合關(guān)系測定 采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。利用生物信息預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-212和HMGA2的結(jié)合片段。采用靶基因網(wǎng)站(mirbase.org、targetscan.org、microrna.org)對miR-212的靶基因進(jìn)行預(yù)測，并在線查找靶基因功能。將擴(kuò)增的HMGA2 3′-UTR序列插入到pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒的位點(diǎn)中，構(gòu)建HMGA2 3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體HMGA2-WT(野生型)及突變載體HMGA2-MUT(突變型)，將上述熒光素酶報(bào)告載體及突變載體與miR-212 NC及miR-212 mimics共同轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞，Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒檢測熒光素酶活性，分析miR-212與HMGA2的結(jié)合關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織及癌旁正常組織中miR-212 mRNA表達(dá)比較 膀胱癌及癌旁正常組織中miR-212 mRNA表達(dá)量分別為1.97±0.24、4.26±0.38，膀胱癌組織中miR-212 mRNA表達(dá)低于癌旁正常組織(P<0.05)。

2.2 兩組膀胱癌細(xì)胞增殖能力比較 對照組和miR-212組A490分別為75.48±6.52和38.69±3.47，miR-212組細(xì)胞增殖能力低于對照組(P<0.05)。

2.3 兩組膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 對照組、miR-212組遷移數(shù)分別為(100.00±9.89)、(64.63±6.89)個(gè)，侵襲數(shù)分別為(53.26±6.12)、(19.03±4.63)個(gè)。miR-212組細(xì)胞遷移和侵襲能力均低于對照組(P均<0.05)。

2.4 兩組細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)比較 對照組、miR-212組HMGA2蛋白表達(dá)分別為0.898±0.077、0.356±0.063，miR-212組HMGA2蛋白表達(dá)低于對照組(P<0.05)。見圖1。

2.5 miR-212與HMGA2的結(jié)合關(guān)系測定 與miR-212 NC相比，miR-212共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，HMGA2-WT表達(dá)水平明顯降低，而HMGA2-MUT相對熒光素酶活性無明顯變化，證實(shí)HMGA2是miR-212的靶基因。見圖2、3。

圖1 兩組細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

圖2 miR-212與HMGA2 mRNA3′-UTR的互補(bǔ)配對序列

注:與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

膀胱癌的病理過程較為復(fù)雜，與吸煙、遺傳和環(huán)境污染等多種因素相關(guān)，發(fā)病機(jī)制呈現(xiàn)出多樣化。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約80%的膀胱癌患者為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)，50%～70%的NMIBC患者易復(fù)發(fā)，且10%～20%的患者可迅速進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)[6]。miR-212基因定位于染色體17p13.3，含有3個(gè)外顯子基因(AK006051)的第1個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，為基因內(nèi)miRNA[7]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-212在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，并參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的進(jìn)程。Wada等[8]在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-212在胃癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，miR-212 的下調(diào)可能通過其靶基因MECP2，發(fā)揮其抗腫瘤的作用；Tu等[9]研究表明，miR-212在肝癌中通過靶向FOXA1基因的表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡的能力；Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-212的表達(dá)可通過靶向調(diào)控PXN基因，使食管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力下降。本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中miR-212 mRNA表達(dá)低于癌旁正常膀胱組織，提示膀胱癌患者組織中miR-212表達(dá)明顯低于癌旁正常組織；miR-212組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均低于對照組，提示上調(diào)miR-212表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，miR-212可能與膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，在膀胱癌中可能發(fā)揮抑癌的作用。

HMGA2是HMG的成員之一。它作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，可通過結(jié)合在DNA序列中AT豐富的區(qū)域，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)揮其功能[11]。HMGA2在正常的組織中一般不表達(dá)或低表達(dá)，而在人瘤組織細(xì)胞中異常分化，呈現(xiàn)高表達(dá)[12]。據(jù)報(bào)道，HMGA2的水平與腎癌腫瘤的大小和Fuhrman分級密切相關(guān)，且HMGA2高表達(dá)提示腎癌患者預(yù)后較差，說明HMGA2在腎癌的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用[13]。Xia等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2在鼻咽癌中可通過激活TGF-β/Smad3信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Shi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HMGA2可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡，從而在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。同時(shí)，多種miRNA可調(diào)控HMGA2的表達(dá)在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。研究顯示，下調(diào)miRNA-Let7a和上調(diào)HMGA2的表達(dá)可促進(jìn)喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]；miR-101可能在胰腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中發(fā)揮腫瘤抑制作用[17]；Chang等[18]研究顯示miR-194作為直接上游抑制調(diào)節(jié)劑，削弱了HMGA2基因的表達(dá)水平，在結(jié)直腸腫瘤中降低細(xì)胞增殖水平和抑制了腫瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-212組膀胱癌細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)低于對照組，提示轉(zhuǎn)染miR-212 mimics后HMGA2蛋白表達(dá)水平明顯下降，表明miR-212可能通過靶向HMGA2的表達(dá)對膀胱癌惡性行為進(jìn)行調(diào)控；為進(jìn)一步探討miR-212抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制，本研究利用miRNA網(wǎng)站預(yù)測miR-212的靶基因，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了HMGA2是miR-212的下游靶基因，表明miR-212對膀胱癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制可能與HMGA2密切相關(guān)。

綜上所述，膀胱癌組織中miR-212表達(dá)降低，上調(diào)miR-212表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用與HMGA2密切相關(guān)，通過靶向調(diào)控HMGA2影響膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，有望成為膀胱癌的一種新的臨床診斷指標(biāo)和分子標(biāo)記物，對膀胱癌生物靶向治療具有重要的意義。