夏成興，孫王宏，馮相鑫，王海峰，顏汝平，何進，禹路，楊德林

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，昆明650101)

眼鏡蛇毒膜毒素12(MT-12)是從中華眼鏡蛇毒粗毒中提取出來的一種堿性膜活性多肽[1]，屬于三指毒素家族，該家族蛋白可以通過高度特異性靶向不同的受體和離子通道實現包括抗炎、抑癌、殺菌等藥理作用。其中其抑癌作用近年來在多種腫瘤的研究中被廣泛報道[2]。本課題組近年來針對MT-12對膀胱癌的抑癌作用進行了系列研究，發(fā)現MT-12在不殺傷正常膀胱上皮細胞的情況下，具有抑制膀胱癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用[3]。但是關于MT-12抑制人膀胱癌細胞侵襲和轉移的作用及分子機制尚不明確。2016年7月～2017年7月，我們應用MT-12作用于膀胱癌細胞系T24、RT4，觀察其對膀胱癌細胞侵襲、轉移能力的影響，探討MT-12抑制腫瘤細胞侵襲轉移的機制，為膀胱癌的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 MT-12單體提取于中華眼鏡蛇毒，由中國科學院昆明動物所動物毒素研究室惠贈；為考察多種膀胱癌細胞，納入兩種人膀胱癌細胞系，分別為膀胱移行上皮細胞癌細胞T24、膀胱移行細胞乳頭狀瘤細胞RT4，均由昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中心試驗室提供；促瘤劑佛波酯(PMA)購于美國Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國GIBCO公司；TaqMan逆轉錄試劑盒、TaqMan PCR Master Mix試劑盒購于美國Applied Biosystems公司；ELISA試劑盒購于上海凱基公司。

1.2 藥物配制 MT-12溶液：將1 g MT-12溶于200 mL DMSO溶液里，配置為5 g/L的貯存濃度，-20 ℃保存。使用時，應用培養(yǎng)基稀釋獲得MT-12工作濃度，分別為0.10、0.25、0.50 μg/mL。PMA溶液：用無水乙醇溶解1 mg PMA，配制成1 mol/L儲存液，-20 ℃保存。使用時應用培養(yǎng)基稀釋成100 nmol/L的工作液。

1.3 細胞培養(yǎng) 細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、CO2體積分數為5%及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.4 細胞遷移能力測算 采用細胞劃痕實驗。將T24、RT4細胞以5×105/孔的密度分別接種于6孔板中，設置空白對照組(Ctrl組)、溶媒對照組(NC組)、0.25 μg/mL組、0.50 μg/mL MT-12組，分別應用PBS、0.1%DMSO、0.25 μg/mL MT-12、0.50 μg/mL MT-12處理細胞24 h。當細胞鋪滿板時，用200 μL移液器吸頭沿底部作“一”字劃痕，處理細胞24 h后觀察測量劃痕距離變化并拍照，計算細胞遷移抑制率=(處理組處理前劃痕寬度-處理組處理后劃痕寬度)/(空白對照組處理前劃痕寬度-空白對照組處理后劃痕寬度)×100%。

1.5 細胞黏附能力測算 采用細胞黏附實驗。將處于對數生長期的T24、RT4細胞以1×105/孔接種于24孔板，當細胞單層鋪滿時，設置空白對照組(Ctrl組)、溶媒對照組(NC組)、0.25 μg/mL、0.50 μg/mL MT-12組，分別應用PBS、0.1%DMSO、0.25 μg/mL MT-12、0.50 μg/mL MT-12處理2 h后，去除未黏附的細胞，每孔加100 μL的0.25% Rose Bengal染色液，室溫靜置5 min后，吸棄染料，每孔加入1∶1的95%乙醇溶液和PBS 200 μL，室溫靜置30 min。在酶聯免疫檢測儀波長570 nm處測定各孔的吸光度(D)值。細胞黏附率=(內皮細胞和腫瘤細胞D值-內皮細胞D值)/內皮細胞D值×100%。

1.6 細胞基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9酶活性含量檢測 采用凝膠酶譜分析法。將T24、RT4細胞接種于6孔板中。待細胞鋪滿后，設置空白對照組(Ctrl組)、MT-12組、PMA組、PMA+MT-12組，分別應用PBS、0.50 μg/mL MT-12、100 nmol/L PMA、0.50 μg/mL MT-12+100 nmol/L PMA干預細胞24 h。24 h后裂解細胞，4 ℃離心，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。配制10% SDS-PAGE膠，其中分離膠含0.1%Ⅳ型膠原。將各組的樣品提取的蛋白，加入泳道(按每泳道100 μg蛋白量計算樣品上樣量，上樣量6～20 μL)，電流強度20 mA，4 ℃電泳90 min，將膠帶置入含2.5% Triton-X 100的培養(yǎng)皿室溫振蕩30 min洗脫后，再加入酶反應液 37 ℃搖床過夜。0.5%考瑪斯亮藍R-250染色室溫振蕩30 min，放入脫色液中至膠原酶消化區(qū)透明清晰為止。凝膠于UV Ipro凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察并攝像，讀取各消化條帶的灰度和面積，計算酶解活性含量=條帶面積×(條帶灰度-背景灰度)。

1.7 細胞侵襲轉移相關因子mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。將T24、RT4細胞接種于6孔板中。待細胞鋪滿后，設置空白對照組(Ctrl組)、MT-12組、PMA組、PMA+MT-12組，分別應用PBS、0.50 μg/mL MT-12、100 nmol/L PMA、0.50 μg/mL MT-12+100 nmol/L PMA干預細胞24 h。TRIzol一步法提取總RNA，cDNA合成及RT-PCR實驗步驟按逆轉錄試劑盒，RT-PCR試劑盒的說明書完成。侵襲轉移相關因子各引物分別為：內參β-actin 正向序列5′-TCCGTGACATCAAGGAGAAGC-3′，反向序列5′-GCACCGTGTTGGCGTAGAG-3′；細胞間黏附因子-1(ICAM-1)正向序列5′-ACCACAGGAGCAACTTCT-3′，反向序列5′-CGTTCAGGACCACTTCAC-3′；血管黏附因子-1(VCAM-1)正向序列5′-ACTTCTGGTTGCTCTATTGTG-3′，反向序列5′-CAGTCATCTCAGTGGTAGTG-3′；血管生成因子(VEGF)正向序列5′-AGGGCAGAATCATCACGAA-3′，反向序列5′-TCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCT-3′。

1.8 細胞VEGF蛋白表達檢測 采用ELISA法。于6孔板中培養(yǎng)T24、RT4細胞，待細胞鋪滿后，設置空白對照組(Ctrl組)、MT-12組、PMA組、PMA+MT-12組，分別應用PBS、0.50 μg/mL MT-12、100 nmol/L PMA、0.50 μg/mL MT-12+100 nmol/L PMA干預細胞24 h。取對數生長期細胞嚴格按照說明書進行操作，VEGF水平采用電化學發(fā)光法進行檢測，所用儀器為 Lumat LB9507化學發(fā)光分析儀。

2 結果

2.1 各組細胞遷移能力比較 T24和RT4細胞中，0.25 μg/mL MT-12組、0.50 μg/mL MT-12組細胞遷移抑制率均低于NC組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細胞黏附能力比較 T24和RT4細胞中，0.25 μg/mL MT-12組、0.50 μg/mL MT-12組細胞黏附率均低于NC組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞遷移、黏附能力比較

2.3 各組細胞MMP-2、MMP-9酶活性比較 T24和RT4細胞中，MT-12組MMP-9酶活性均低于Ctrl組(P均<0.05)，PMA組MMP-9酶活性均高于Ctrl組，PMA+MT-12組MMP-9酶活性均低于PMA組(P均<0.05)。T24和RT4兩株細胞中，各組間MMP-2酶活性差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1～4。

注：1為Ctrl組；2為MT-12組；3為PMA組；4為PMA+MT-12組。

2.4 各組細胞ICAM-1、VCAM-1、VEGF mRNA表達比較 T24和RT4細胞中，MT-12組ICAM-1及VEGF的mRNA表達均低于Ctrl組(P均<0.05)，而VCAM-1差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。PMA組ICAM-1及VEGF mRNA表達均高于Ctrl組，PMA+MT-12組ICAM-1、VEGF mRNA表達均低于PMA組(P均<0.05)。見圖5～7。

2.5 各組細胞VEGF蛋白表達比較 T24和RT4細胞中，MT-12組與Ctrl組VEGF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；PMA組VEGF蛋白表達均高于Ctrl組，PMA+MT-12組VEGF蛋白表達均低于PMA組(P均<0.05)。見圖8。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，近年來發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[4,5]，10%～30%的病例會進展為具有高度侵襲性、可迅速進展和轉移的肌層浸潤性膀胱癌[6]，預后往往不佳[7]。故探討膀胱癌侵襲轉移的分子機制，研究抑制其轉移能力的藥物，在膀胱癌抗腫瘤研究中尤為重要。

圖3 T24、RT4細胞中MMP-2酶活性表達比較

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

注：與Ctrl組比較，*P<0.05；與PMA組比較，#P<0.05。

MT作為眼鏡蛇毒中提取的膜活性多肽，其對腫瘤的選擇性殺傷作用近年來被廣泛報道[8]。有學者報道了MT同類毒素CTX1對不同細胞系的毒性作用，包括癌細胞(MCF-7、P388、K562、H22)和正常支氣管上皮細胞16HBE，發(fā)現CTX1對腫瘤細胞的毒性顯著高于正常細胞[9]。同時大量研究表明，MT也可一定程度抑制腫瘤細胞的侵襲轉移能力。有學者在對乳腺癌的研究中發(fā)現，CTXⅢ能夠通過抑制EGF/EGFR和Src介導的信號傳導途徑來抑制細胞轉移[10]；在口腔癌中，CTXⅢ可以通過MAPK和MMP信號傳導途徑抑制癌細胞的增殖和遷移[11]。因此，MT-12作為中華眼鏡蛇MT單體，可能具有抑制腫瘤細胞轉移侵襲能力的潛力。本研究發(fā)現，RT4和T24兩株細胞中，0.25 μg/mL MT-12組、0.50 μg/mL MT-12組細胞遷移抑制率、細胞黏附率均低于NC組，提示MT-12低濃度(0.25 μg/mL)及高濃度(0.50 μg/mL)可明顯抑制膀胱癌細胞遷移及黏附；考慮到RT4是膀胱移行細胞乳頭狀瘤，T24是膀胱移行上皮細胞癌，兩種細胞的惡性程度不同、腫瘤驅動基因不同、基因突變情況不同，固而本研究結果也表明MT-12對不同膀胱癌細胞的侵襲、轉移均有顯著抑制作用。

腫瘤發(fā)生侵襲與轉移是影響患者預后的重要原因。研究表明，腫瘤的侵襲轉移和腫瘤細胞與其細胞外基質之間的相互作用密切相關[12]。而基質金屬蛋白酶(MMPs)和絲氨酸蛋白水解酶介導的基膜和細胞外基質的降解和細胞遷移過程貫穿于腫瘤侵襲和轉移的整個過程[13]。其中MMPs是一種鰲合了鋅離子的蛋白酶類，主要作用底物為細胞外基質中的Ⅳ型膠原蛋白，通過降解細胞外基質，可以促進細胞向周圍組織及血管的侵襲轉移能力[14]。在腫瘤細胞中，MMPs表達量往往顯著高于正常細胞，且其表達及活性與腫瘤細胞的惡性程度呈正相關[15]。其中Ⅳ型膠原蛋白酶是內皮細胞和腫瘤細胞分泌的MMPs中最重要的一個，其主要形式為糖化的MMP-9及非糖化的MMP-2[16]。Fiorentini等[17]研究發(fā)現，通過抑制MMP-2和MMP-9的活性降低了人轉移性前列腺癌細胞和膀胱癌細胞的侵襲性。Yue等[18]研究也證實，人參皂苷Rg3可通過降低細胞MMP-9的活性，抑制惡性腫瘤的侵襲和轉移。目前，MMP-9已成為評估腫瘤侵襲轉移能力的重要指標，靶向MMP-9已成為臨床防治腫瘤侵襲轉移的重要策略。本研究結果顯示，RT4和T24兩株細胞中，MT-12組MMP-9酶活性均低于Ctrl組，提示MT-12可能通過抑制 MMP-9的活性，減緩細胞外膠原蛋白的降解，進而抑制細胞的侵襲轉移。

VEGF在腫瘤的侵襲過程中有著重要的地位，不但可以促進腫瘤血管生成，同時可促進血管內皮細胞的收縮，從而加速腫瘤向血管浸潤的過程[19,20]。研究發(fā)現，惡性腫瘤細胞可旁分泌大量VEGF，提高局部血管通透性，導致周圍纖維蛋白沉著，促進單核細胞、內皮細胞和成纖維細胞的浸潤，有利于形成腫瘤基質，促進腫瘤細胞進入新生血管，增強其轉移能力[21]。Nowicki等[22]研究表明，VEGF作為血管內皮特異性標記物，在肝癌患者血清中升高，并且與侵襲性、轉移和生存期較短密切相關。因而，降低細胞VEGF的表達，是抑制腫瘤侵襲轉移的潛在靶點。本研究結果顯示， MT-12組VEGF mRNA表達均低于Ctrl組，提示MT-12對膀胱癌細胞侵襲、轉移的抑制作用可能與其抑制VEGF mRNA及蛋白表達有關。

細胞黏附分子(CAMs)在調控腫瘤細胞的黏附及轉移中同樣起到重要作用。CAMs是一類調節(jié)細胞與細胞之間，細胞與胞外基質間相互結合并起黏附作用的膜表面糖蛋白[23]。在對腫瘤生物學行為的研究中，CAMs中的ICAM-1及VCAM-1對腫瘤侵襲轉移能力影響的研究較多[24]。研究表明，當腫瘤細胞大量表達ICAM-1及VCAM-1時，可促進腫瘤細胞黏附于血管內皮細胞，同時大量富集巨噬細胞，促進VEGF等生長因子的分泌，最終導致腫瘤微血管生成，促進腫瘤的轉移[25]。Tuncer等[26]在結直腸癌中通過增強TSP-1和ICAM-1的表達改變內皮細胞特征，發(fā)現可增強細胞的侵襲能力。本研究發(fā)現，MT-12組ICAM-1 mRNA表達均低于Ctrl組，提示MT-12可能通過抑制ICAM-1的表達，抑制腫瘤細胞的黏附能力，從而抑制不同膀胱癌細胞的轉移。

同時，為進一步明確MT-12對膀胱癌細胞侵襲、轉移抑制作用的分子機制，我們將PMA處理膀胱癌細胞納入本研究。PMA作為高效促瘤劑，通過活化蛋白激酶C，激活下游信號通路，促進腫瘤的生長、轉移。本研究發(fā)現，PMA+MT-12組MMP-9酶活性、ICAM-1 mRNA、VEGF mRNA及蛋白表達均高于Ctrl組，表明PMA進一步增強了膀胱癌細胞的促瘤作用；PMA+MT-12組MMP-9酶活性、ICAM-1 mRNA、VEGF mRNA及蛋白表達均低于PMA組，提示MT-12對膀胱癌細胞侵襲、轉移能力的抑制作用涉及對細胞MMP-9、VEGF、ICAM-1的調控。

綜上所述，MT-12可以有效抑制膀胱癌細胞的遷移及轉移能力，其發(fā)揮抑制作用的分子機制可能為降低腫瘤細胞中MMP-9、VEGF、ICAM-1的表達。