林美娜,章 濤,許瑞元,梅序橋,郭月麗

(1漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系臨檢教研室,漳州 363000;2福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)免疫系;3福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院檢驗(yàn)科;*通訊作者,E-mail:zjdrzht@mail.fjmu.edu.cn)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以持續(xù)性滑膜炎癥、系統(tǒng)性炎癥和關(guān)節(jié)不可逆損傷為特征的自身免疫性疾病。當(dāng)前,RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。曹永賀等[2]通過RA外周血CD4+T細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的研究,認(rèn)為CD4+T細(xì)胞凋亡不足,機(jī)體免疫狀態(tài)紊亂,分泌的大量的炎性細(xì)胞因子作用于關(guān)節(jié)滑膜組織,形成血管翳,侵蝕或破壞骨和軟骨,造成關(guān)節(jié)損害,引起RA的發(fā)生或加重。由于RA是一種系統(tǒng)性炎癥性疾病,其免疫病理事件涉及循環(huán)中大部分的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等,且關(guān)節(jié)內(nèi)的活化炎癥細(xì)胞均可由外周激活的細(xì)胞池中募集而來。因此,對PBMC的研究可能更能反映患者的整體病理狀況[3]。本研究采用real-time qPCR方法檢測RA患者PBMC中bcl-2、c-FLIP、caspase-8凋亡相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)水平,采用蛋白免疫印跡法檢測c-FLIP、caspase-8蛋白表達(dá)水平,分析它們與疾病不同活動期的相關(guān)性及其在RA中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2014-01～2015-06入住漳州市醫(yī)院血液風(fēng)濕內(nèi)科的患者60例,其中女40例,男20例,平均年齡(46.75±13.52)歲(32-78歲),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)為2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會與歐洲風(fēng)濕病學(xué)會聯(lián)合提出的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。按RA疾病活動指數(shù)(DAS28)將60例標(biāo)本分為低度活動期組(DAS28<3.2)22例、中度活動期組(DAS28 3.2-5.1)20例、高度活動期組(DAS28>5.1)18例。25例門診健康體檢者設(shè)為對照組,其中女18例,男7例,平均年齡(45.35±14.02)歲(31-80歲)。RA組和對照組均排除其他自身免疫性疾病及腫瘤的可能,采血前2周無任何感染性疾病史。

1.2 主要試劑與儀器

引物序列由上海生工有限公司設(shè)計(jì)合成;Anti-CFLAR TRUEMAB Antibody Clone OTI2D3購于美國ORIGENE公司;Caspase-8 Antibody、Beclin 1 Antibody購于無錫藥明康德新藥開發(fā)股份有限公司;RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、HRP標(biāo)記的抗兔二抗購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。721分光光度儀購于上海精科實(shí)業(yè)有限公司;JY-SCZ4+型垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置購于生工生物工程(上海)股份有限公司;GIS300凝膠成像分析系統(tǒng)購于南京馳順科技發(fā)展有限公司;real-time qPCR儀器購于美國ABI公司。

1.3 臨床資料收集

收集整理60例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的相關(guān)臨床資料,如:患者的性別、年齡、病程以及用藥等一般情況;血沉(ESR)、C反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子RF、抗CCP等輔助檢查結(jié)果信息;晨僵持續(xù)時(shí)間、疼痛程度、疼痛持續(xù)時(shí)間、疼痛28關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)、疼痛總數(shù)、(DAS28)活動度等患者病例情況。

1.4 PBMC的提取和處理

分別采集健康體檢者和RA患者靜脈血2 ml,采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法[5]分離PBMC,一部分-20 ℃過夜保存,另一部分-80 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 熒光定量PCR檢測Bcl-2、c-FLIP、caspase-8 mRNA的表達(dá)

總RNA的提取:參照北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen)RNA提取試劑盒TransZol Up Plus RNA Kit(Cat.No.:ER501-01)說明書。PBMC經(jīng)PBS洗滌后加入1 ml Trizol充分裂解;加入氯仿200 μl混勻、室溫靜置5 min;4 ℃ 12 000 r/min離心5 min,取上清約400 μl轉(zhuǎn)移到新的EP管中;加500 μl預(yù)冷異丙醇,靜置10 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min;加入1 ml無水乙醇洗滌沉淀物,4 ℃ 8 000 r/min離心5 min;加入50 μl DEPC水,56 ℃助溶總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA逆轉(zhuǎn)錄：RNA逆轉(zhuǎn)錄參照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Trans Script Reverse Transcriptase[M-MLV,RNaseH](Cat.No.:AT101-02)說明書進(jìn)行。提取總RNA分光光度計(jì)定量RNA,模板RNA加water共10.5 μl，加入primer Random或Oligo(dt)1 μl，85 ℃ 5 s后置冰上。反應(yīng)條件：Step 1，42 ℃ 15 min；Step 2，85 ℃ 5 s。得到的cDNA放置-20 ℃冰箱中備用，或者立即用于real-time qPCR反應(yīng)。

real-time qPCR:反應(yīng)體系及反應(yīng)條件采用北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的模板濃度、退火溫度,確保PCR引物的特異性及PCR擴(kuò)增效率(引物見表1)。在冰上進(jìn)行配制real-time qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:2×TransStarTMTop Green qPCR SuperMix 10.0 μl;Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μl;Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μl;cDNA template 2.0 μl;ddH2O Up to 20 μl。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次,配制反應(yīng)體系時(shí)先配制總的反應(yīng)液,再各個(gè)分裝。選擇Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行定時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,以GAPDH為內(nèi)參基因,2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)水平,比較各基因分別在不同組織樣本中的表達(dá)差異,得到表達(dá)差異分析結(jié)果。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物系列Table 1 Primer sequences for real-time RT-PCR

1.6 Western blot檢測c-FLIP、caspase-8表達(dá)水平

PBMC細(xì)胞,用1×PBS洗2次,加入含蛋白酶抑制劑cooktail的RIPA強(qiáng)裂解液400 μl,冰上充分裂解15 min;將裂解液移入1.5 ml離心管,在冰上用超聲細(xì)胞裂解器裂解;將液體移入1.5 ml離心管,4 ℃,12 000 r/min離心15 min;取上清移入另外一新離心管;BCA法進(jìn)行蛋白定量;蛋白樣品加入1/4體積上樣緩沖液沸水煮5 min,使蛋白質(zhì)充分變性。經(jīng)SDS-PAGE,濕式轉(zhuǎn)膜法將膠上的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至NC膜上,恒壓100 V,冰浴中轉(zhuǎn)120 min;NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST洗膜5 min;將膜封入含1 ∶1 000稀釋一抗的塑料袋中,置于4 ℃搖床孵育冰箱過夜,TBST洗膜5 min,3次;將膜封入含1 ∶5 000稀釋二抗的塑料袋中,室溫?fù)u床孵育1 h,TBST洗膜5 min,3次;掃描膠片,用南京馳順科技發(fā)展有限公司的GIS300凝膠成像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和光密度相對比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RA患者PBMC中Bcl-2、c-FLIP、caspase-8 mRNA表達(dá)情況

經(jīng)組間兩兩比較,各組RA患者PBMC中Bcl-2 mRNA僅低活動組水平升高(P=0.009),中、高活動組明顯降低。c-FLIP mRNA低、中、高活動組均明顯高于健康對照組(均P<0.05),且呈遞進(jìn)性升高。caspase-8的低、中、高活動組mRNA也均高于對照組(均P<0.05),以中活動組為最高(見表2)。

表2 各組Bcl-2、c-FLIP、caspase-8 mRNA表達(dá)情況Table 2 Comparison of Bcl-2, c-FLIP and caspase-8 mRNA expression among four groups

2.2 RA患者PBMC c-FLIP、caspase-8蛋白表達(dá)變化

中活動組RA患者PBMC c-FLIP蛋白表達(dá)顯著高于健康對照組(P<0.05),低、高活動組與健康對照比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中、高活動組RA患者PBMC caspase-8蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05);低活動組與對照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3,圖1)。

表3 各組c-FLIP、caspase-8蛋白表達(dá)結(jié)果Table 3 Western blot results of c-FLIP and caspase-8 protein expression

圖1 c-FLIP、caspase-8蛋白表達(dá)Western bolt結(jié)果Figure 1 Protein expression of c-FLIP and caspase-8 by Western blot

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,主要特性是滑膜組織炎癥,引起關(guān)節(jié)損傷,導(dǎo)致功能障礙[6]。關(guān)節(jié)病變與成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞腫瘤樣增生和細(xì)胞凋亡之間失去平衡有關(guān)[7]。

細(xì)胞凋亡是一種生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外源信號誘導(dǎo)下,其死亡途徑被激活,在相關(guān)基因參與的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡的過程。目前主要包括兩條經(jīng)典途徑:內(nèi)源性途徑和外源性途徑。外源性途徑也稱作死亡受體途徑,由于各種細(xì)胞凋亡信號的刺激,fas類死亡受體與相應(yīng)配體相結(jié)合,信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部,吸引了胞質(zhì)中另一種帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白FADD的結(jié)合,形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物DISC,募集并激活caspase-8,從而引起下游caspase-3等的級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性凋亡途徑又叫線粒體途徑,在內(nèi)源凋亡信號刺激下,線粒體外膜的完整性喪失,凋亡性膜間蛋白(如細(xì)胞色素C)釋放,細(xì)胞色素c與Apaf-1在ATP/dATP存在下發(fā)生構(gòu)象變化,形成凋亡體,同時(shí)凋亡體吸引caspase-9前體加入該復(fù)合體,引起凋亡起始分子caspase-9凝集和激活。caspase-9激活效應(yīng)分子caspase-3引發(fā)凋亡的降解過程[8]。

Bcl-2是目前研究比較廣泛的凋亡抑制蛋白。Bcl-2由B淋巴細(xì)胞瘤-2基因編碼的產(chǎn)物,是細(xì)胞存活促進(jìn)因子,屬膜整合蛋白,分子量為26 kDa,定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和連續(xù)的核周膜[9]。Bcl-2的生物學(xué)作用是調(diào)控細(xì)胞的存活期,而不影響細(xì)胞增殖[10]。Bcl-2可以通過參與信號傳遞而抑制細(xì)胞凋亡[11]。在發(fā)生凋亡過程中,Bcl-2家族的促凋亡蛋白(如Bax)在移位到線粒體膜上后,很快形成同源二聚體,破壞線粒體完整性,釋放線粒體內(nèi)的促凋亡因子,經(jīng)過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑逐步放大,最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生,而Bcl-2可以與Bax形成二聚體,從而導(dǎo)致在Bax誘發(fā)凋亡過程中對其功能進(jìn)行限制[12]。

有關(guān)Bcl-2在RA的細(xì)胞凋亡作用有一定的研究,然而研究報(bào)道不一,NaKajima等[13]首先報(bào)道了RA滑膜細(xì)胞表達(dá)fas抗原,且fas抗體可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡。CD4+T細(xì)胞凋亡減少與促凋亡基因Fas表達(dá)減少,凋亡相關(guān)蛋白caspase-8表達(dá)降低及抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)增高有關(guān)[14]。而Isomaki等[15]在對RA患者細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究中,未觀察到PBMC和滑膜組織中Bcl-2表達(dá)的增加,推測Bcl-2可能沒有發(fā)揮重要作用。本研究外周血單個(gè)核細(xì)胞Bcl-2 mRNA中只有低活動組高于健康對照組,中、高活動組反而降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,caspase-8的mRNA低、中、高活動組均高于健康對照組,caspase-8蛋白表達(dá)低活動組與健康對照組比較無顯著差異,中、高活動組顯著增高,Bcl-2的凋亡抑制作用體現(xiàn)不明顯。

c-FLIP是20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白,它在多種腫瘤和炎癥反應(yīng)中,可以阻斷腫瘤壞死因子α(TNFα)、Fas配體(FasL)和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)等誘導(dǎo)的凋亡。Fas介導(dǎo)形成的DISC活化caspase-8的能力主要受到c-FLIP的調(diào)控,c-FLIP存在幾種結(jié)構(gòu)上類似于caspase-8但缺乏酶活性的異構(gòu)體,c-FLIP的兩個(gè)DED在體外能與FADD和Caspase-8結(jié)合,抑制Caspase-8結(jié)合到DISC上,使DISC喪失介導(dǎo)處理和釋放有活性的caspase-8的能力,從而阻斷了Fas介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。

目前,c-FLIP在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中有了一定的研究。國外有研究發(fā)現(xiàn),RA的滑膜細(xì)胞及淋巴細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的凋亡敏感性降低與DISC形成障礙,特別是與Caspase-8激活受到抑制有關(guān),而FLIP的表達(dá)增加則可能參與了抑制DISC的形成并抑制Caspase-8的激活[17]。吳鳳霞等[18]研究結(jié)果認(rèn)為RA滑膜組織中抗凋亡分子FLIP表達(dá)增高,而且與RA滑膜炎癥程度積分相關(guān)。本研究PBMC中c-FLIP mRNA水平低、中、高活動組分別隨著RA疾病的進(jìn)程逐漸增加,Caspase-8總體趨勢增加,這可能是c-FLIP的DED區(qū)與Caspase-8結(jié)合,競爭性抑制Caspase-8結(jié)合到DISC上,阻礙Caspase-8的活化,從而抑制細(xì)胞凋亡。c-FLIP蛋白水平只有M組明顯增高,可能與c-FLIP的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述,本研究PBMC中c-FLIP mRNA表達(dá)水平隨著RA疾病的進(jìn)程增高,而Bcl-2只有低活動組有明顯增高。相比Bcl-2,可能c-FLIP在RA的凋亡抑制作用更大。由于細(xì)胞凋亡參與的途徑多樣、涉及的因子復(fù)雜,有關(guān)RA凋亡機(jī)制在PBMC中的研究還有待進(jìn)一步的深入,本研究初步探討了Bcl-2、c-FLIP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平及其作用機(jī)制,可為后續(xù)研究提供一定的參考。