馬士芬,王娟紅,魏 威,方航榮,段 瑛,黑利娟,徐俊榮

(1西安交通大學醫(yī)學院附屬西安市中心醫(yī)院消化科,西安 710003;2延安大學醫(yī)學院;3西安交通大學醫(yī)學院附屬西安市中心醫(yī)院病理科;4西安市第三醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:657237987@qq.com)

橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)是最常見的器官特異性自身免疫性疾病之一,女性發(fā)病率是男性的3-4倍,歐洲發(fā)病率為0.1%-5%,中國發(fā)病率為0.4%-1.5%[1]。它的主要特征是甲狀腺組織內(nèi)大量的淋巴細胞浸潤,甲狀腺腫大、纖維化,甲狀腺細胞逐漸破壞,最終導(dǎo)致甲狀腺功能減退[2]。HT的發(fā)病機制尚未完全明確,有研究發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細胞免疫失衡在HT的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。但是,研究結(jié)果相互矛盾,一些研究認為HT患者血清中Th1型細胞因子亢進占優(yōu)勢[3],另一些研究結(jié)果提示HT患者血清內(nèi)Th2型細胞因子水平顯著增高。為探討Th1/Th2細胞免疫失衡在HT發(fā)病過程中的作用,本研究擬采用多種方法對HT患者血清及病變甲狀腺組織中的Th1或Th2型細胞因子進行檢測、分析。

1 資料與方法

1.1 病例資料

20例HT患者血清樣品均來自西安市中心醫(yī)院外科及內(nèi)分泌科經(jīng)臨床、甲狀腺功能檢測、手術(shù)及病理確診病例,另外選取18例查體正常人群血清為對照。20例HT石蠟組織標本來自西安市中心醫(yī)院病理科2010-01～2014-02存檔蠟塊;同期18例甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺石蠟組織標本作為對照組,其中,女17例,男1例,年齡25-67歲,平均年齡46.5歲。

1.2 主要試劑與實驗方法

1.2.1 主要試劑 RayBiotech QAH-TH-1抗體芯片細胞因子定量檢測試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技有限公司;細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6檢測ELISA試劑盒購自上海森雄公司;免疫組化抗體小鼠抗人TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-4R、IL-6R單克隆抗體購自福州邁新公司;SP二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。

1.2.2 抗體芯片法檢測HT患者血清中細胞因子濃度 選擇15例HT患者及13例正常查體人群,常規(guī)采血2 ml,室溫靜置1 h,3 000 r/min離心10 min,取血清1 ml,-70 ℃保存。采用RayBiotech QAH-TH-1抗體芯片細胞因子定量檢測試劑盒檢測血清中10種細胞因子濃度,主要包括Th1細胞因子IL-2、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α和Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13。實驗完成后,將玻片框架拆掉,芯片送廣州瑞博奧生物科技有限公司,采用激光掃描儀InnoScan 300 Microarray Scanner,在波長532 nm,分辨率10 μm進行掃描,采用QAH-TH-1的數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 ELISA法檢測HT患者血清中細胞因子濃度 對5例HT病例及5例正常查體人群,常規(guī)采血2 ml,室溫靜置1 h,3 000 r/min離心10 min,取血清1 ml,-70 ℃保存。細胞因子IL-4、IL-6、IFNγ及TNF-α均采用雙抗體夾心ELISA法檢測。用全自動酶標分析儀測A450 nm值,依標準品值制作標準曲線,計算細胞因子濃度(ng/L)。具體步驟按說明書嚴格操作。

1.2.4 免疫組化檢測甲狀腺組織中細胞因子及細胞因子受體蛋白表達 用免疫組織化學方法檢測20例HT病變甲狀腺組織及18例正常的甲狀腺組織中Th1型細胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型細胞因子IL-4、IL-6的表達及其相應(yīng)細胞因子受體的蛋白表達情況(用陽性例數(shù)/總例數(shù)的百分數(shù)表示)。同時,觀察分泌細胞因子的細胞類型。免疫組化染色采用常規(guī)鏈霉菌素親生物素-過氧化酶連接法(SP法)。TNF-α、IFN-γ單抗1 ∶50稀釋,IL-4、IL-6單抗1 ∶200稀釋,IL-4R、IL-6R單抗1 ∶100稀釋,以胞漿呈棕黃色為陽性,陰性對照為用PBS代替一抗或用含有小鼠單抗IgG1的神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP,Dako)稀釋至與一抗相同IgG1濃度代替單抗。

2 結(jié)果

2.1 抗體芯片法定量檢測血清中10種Th1/Th2細胞因子表達水平

與正常對照組相比較,HT組血清中IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α濃度水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見表1),其余7種細胞因子差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

2.2 ELISA法檢測血清中Th1型細胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型細胞因子IL-4、IL-6的濃度水平

ELISA法檢測5例HT患者,5例正常人血清,結(jié)果顯示,與正常人血清相比較,HT患者Th2型細胞因子IL-4、IL-6濃度水平均顯著升高,Th1型細胞因子TNF-α濃度水平在HT患者顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見表2);IFN-γ在HT患者中無顯著變化(P>0.05,見表2)。

表1 抗體芯片法檢測HT患者及正常人血清中細胞因子濃度結(jié)果 (pg/ml)Table 1 Concentrations of cytokines in serum of HT patients and normal subjects by antibody chip method (pg/ml)

2.3 免疫組織化學方法檢測正常對照組及HT組甲狀腺組織中細胞因子及其受體表達

用免疫組織化學(IHC)方法研究HT患者病變甲狀腺組織中Th1型細胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型細胞因子IL-4、IL-6的表達及其相應(yīng)細胞因子受體的表達情況;同時,觀察分泌細胞因子的細胞類型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HT組甲狀腺組織中IL-4、IL-6細胞因子蛋白主要表達于甲狀腺病變上皮細胞內(nèi),部分表達于浸潤的淋巴細胞(見圖1)。HT組與對照組相比較,Th2型細胞因子IL-4、IL-6蛋白表達均顯著升高,且IL-4、IL-6受體在HT中也顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);Th1型細胞因子TNF-α、IFN-γ蛋白表達在正常與病變甲狀腺組織內(nèi)表達無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,見表3)。

表2 ELISA法檢測HT患者與正常人血清中細胞因子濃度表達水平 (pg/ml)Table 2 Expression level of cytokine in serum of HT patients and normal subjects by ELISA (pg/ml)

3 討論

HT是常見的自身免疫性甲狀腺疾病之一,它的發(fā)病機制尚未完全明確,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)細胞因子在HT的發(fā)病過程中扮演重要的角色。細胞因子是一類在體內(nèi)有廣泛生物學效應(yīng)的多肽物質(zhì),主要包括Th1細胞分泌的IL-2、IFN-γ和TNF-α以及Th2細胞分泌的IL-4、IL-6、IL-13等細胞因子,Th1細胞因子主要介導(dǎo)細胞免疫,而Th2細胞因子促進抗體的產(chǎn)生,介導(dǎo)體液免疫[4]。Th1/Th2細胞因子的平衡在維持機體免疫功能的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用,失衡則可引起免疫介導(dǎo)的疾病。有研究[3]發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細胞免疫失衡在HT的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用,表現(xiàn)為Th1細胞因子亢進占優(yōu)勢。而同為自身免疫性疾病的Graves’病卻表現(xiàn)為Th2細胞因子亢進占優(yōu)勢。

A.IL-4胞漿陽性(SP法,×40);B.IL-4R胞漿陽性(SP法,×40);C.IL-6胞漿陽性(SP法,×100);D.IL-6R胞漿陽性(SP法,×40)

表3 HT與正常甲狀腺組織中細胞因子及其受體免疫組化檢測陽性率比較 例(%)Table 3 Comparison of positive rate of immunohistochemical detection of cytokines and their receptors between HT and normal thyroid tissue cases(%)

在本研究中,我們采用多種方法定性及定量檢測HT患者血清及病變組織中細胞因子濃度及蛋白表達?？贵w芯片定量檢測發(fā)現(xiàn),HT組IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α濃度水平顯著升高;ELISA法和IHC法分別檢測HT患者血清及病變組織中Th1型細胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型細胞因子IL-4、IL-6的濃度及其蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HT組Th2型細胞因子IL-4、IL-6在血清中濃度及組織中蛋白表達均顯著升高,IL-4、IL-6受體在HT甲狀腺組織中蛋白表達水平也顯著增高,細胞因子蛋白及受體蛋白主要表達于甲狀腺病變上皮細胞內(nèi),部分表達于浸潤的淋巴細胞胞漿內(nèi),這些結(jié)果提示Th2型細胞因子IL-4、IL-6在HT的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

IL-4通常由Th2細胞、肥大細胞、嗜堿細胞產(chǎn)生,多數(shù)研究證明IL-4水平在自身免疫性疾病中顯著升高[5]。有文獻報道[6]Th2細胞產(chǎn)生的IL-4、IL-13可增加雙氧化酶2及其表達水平,使細胞外產(chǎn)生大量H2O2進而通過氧化應(yīng)激損傷甲狀腺細胞。覃偉武等[7]發(fā)現(xiàn)HT患者血清中TNF-α、IL-4含量均顯著高于正常對照組,提示Th1和Th2兩型細胞因子水平均增高。Santaguida等[8]研究發(fā)現(xiàn)IL-4+淋巴細胞增加與自身免疫性甲狀腺疾病和非內(nèi)分泌自身免疫性疾病有關(guān)。以上研究均表明IL-4在自身免疫性甲狀腺疾病中扮演著重要的角色。

IL-6作為一種多效性細胞因子,參與機體的多種病理和生理過程。有證據(jù)表明,在肥胖及自身免疫性疾病中IL-6水平明顯升高,如類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性蕁麻疹、克羅恩病等疾病中;在自身免疫性甲狀腺疾病中,如Graves’病、亞急性甲狀腺炎、胺碘酮誘發(fā)的甲狀腺毒癥中也顯著升高[9]。關(guān)于IL-6與HT之間關(guān)系的研究尚少,Ruggeri等[10]研究發(fā)現(xiàn)HT患者IL-6水平是增高的;Siemińska等[9]也發(fā)現(xiàn)與對照組相比,HT的女性血清中IL-6水平有所增加,這表明IL-6與疾病的發(fā)展有關(guān)。IL-6可以調(diào)節(jié)甲狀腺細胞的生長與分化,在甲狀腺疾病中表達增強,從而誘導(dǎo)單核細胞趨化因子蛋白1(MCP-1)在濾泡細胞中產(chǎn)生,并增強淋巴細胞浸潤,其在甲狀腺細胞中的表達與淋巴細胞浸潤程度呈正相關(guān)[11,12]。本研究在HT患者血清中發(fā)現(xiàn)IL-6水平明顯升高,甲狀腺病變組織中蛋白表達增高,提示IL-6可能與HT發(fā)病相關(guān)。

IL-4、IL-6作為Th2型細胞因子,可誘導(dǎo)B淋巴細胞增殖、分化和成熟,促使其產(chǎn)生IgE和IgG等抗體,抑制Th1型自身反應(yīng)性T細胞分化激活而介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[4]。從而使Th1/Th2細胞因子的平衡向Th2型細胞因子偏移,表現(xiàn)為Th2細胞因子亢進占優(yōu)勢。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)HT患者的Th1/Th2細胞平衡向Th1方向偏離,我們的研究通過三種不同的方法,在HT患者血清及組織中均發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-6水平增高,蛋白表達也顯著增高,提示HT中細胞因子失衡向Th2方向偏離。

我們考慮這一結(jié)果可能與研究對象的疾病進展時期不同有關(guān),以往的文獻[4,7,9]中研究的HT患者幾乎均處于臨床早期診斷階段,并基于血清學研究結(jié)果。我們的研究中,HT患者均為已經(jīng)形成甲狀腺結(jié)節(jié),處于臨床HT較晚期,臨床已經(jīng)無法鑒別疾病良、惡性而行手術(shù)切除患者。據(jù)文獻報道[13,14],形成甲狀腺結(jié)節(jié)的HT患者中,甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率顯著升高,黏膜相關(guān)B細胞淋巴瘤的發(fā)病率也顯著升高。在臨床病理診斷過程中,手術(shù)切除的HT患者甲狀腺結(jié)節(jié)組織需要仔細取材,尋找是否有上皮癌變成分。我們的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-6及其受體均存在于HT病變甲狀腺上皮細胞及浸潤的淋巴細胞內(nèi),這一發(fā)現(xiàn)也符合橋本甲狀腺炎上皮細胞嗜酸性化生、異型增生、癌變這一臨床病理過程及黏膜相關(guān)淋巴瘤源于HT組織中浸潤的淋巴細胞這一理論。因此,HT患者中,TH2型細胞因子IL-4、IL-6增高可能與HT惡變(甲狀腺乳頭狀癌及黏膜相關(guān)B細胞淋巴瘤)相關(guān)。

HT的發(fā)生機制錯綜復(fù)雜,與環(huán)境、基因、細胞因子失衡等多方面相關(guān)。大量文獻表明HT與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生相關(guān)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-6在HT患者血清中水平增高,病變組織中表達增高,且IL-4、IL-6受體在HT患者甲狀腺組織中也高表達,提示IL-4、IL-6可能在HT的發(fā)生、發(fā)展、惡變過程中可能發(fā)揮了一定的作用。我們的研究結(jié)果為通過檢測血清學細胞因子監(jiān)測HT早期惡變提供了新的研究思路。