付國強(qiáng),王伯良,魏 妮,黃 潭,周 丹

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科,西安 710038)

百草枯(paraquat,PQ)是一種兼有內(nèi)吸作用的接觸滅生性除草劑,口服中毒對人體會產(chǎn)生致命性損傷。PQ中毒機(jī)制復(fù)雜,公認(rèn)的觀點為氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子激活等[1]。臨床研究表明:具有免疫抑制作用的激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺早期應(yīng)用,能夠降低炎性介質(zhì)釋放,降低多器官功能衰竭發(fā)生率[2]。因此,了解PQ中毒后免疫系統(tǒng)的變化顯得十分重要。

T細(xì)胞免疫在炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用,其活化需要雙重刺激信號,其中第二類共刺激信號能減弱、限制和(或)終止T細(xì)胞免疫應(yīng)答,抑制炎癥反應(yīng),程序性死亡因子(programmed death,PD)1及其配體(PD-L)信號通路是其中重要成員[3]。免疫激活所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是百草枯中毒發(fā)病機(jī)制之一,作為影響T細(xì)胞免疫的重要因素,PD-1及其配體在百草枯中毒后會產(chǎn)生怎樣的變化,這些變化會對病情產(chǎn)生怎樣的影響?目前尚缺乏相關(guān)研究。本實驗以PQ中毒患者為研究對象,檢測中毒后24 h,72 h,120 h外周血CD4+T細(xì)胞PD-1和PD-L1陽性率及PD-1和PD-L1在外周血單個核細(xì)胞中的蛋白表達(dá),同時觀察血清IL-10及TNF-ɑ表達(dá)水平,探討CD4+T細(xì)胞PD-1/PD-L1信號通路和中毒后免疫變化之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

PQ中毒患者30例(均為口服中毒)作為中毒組,剔除中毒前肺炎、扁桃體炎、上呼吸道感染等感染性疾病患者,男12例,女18例,年齡15-68歲,平均(31.67±6.72)歲?？诜?0%百草枯溶液10-30 ml,平均(19.17±2.25)ml。觀察點為中毒后24 h,72 h,120 h。所有PQ中毒患者采用相同的救治方法:清除毒物(洗胃、蒙脫石散吸附、甘露醇導(dǎo)瀉、血液凈化);抗氧化劑治療(大劑量維生素E及大劑量維生素C,還原性谷胱甘肽);保護(hù)重要臟器等常規(guī)治療;且均未應(yīng)用激素及免疫抑制劑。選取同時期本院健康體檢者30例為對照組,其中男16例,女14例;年齡17-65歲,平均年齡(32.45±7.36)歲。納入與排除標(biāo)準(zhǔn):各項常規(guī)體檢項目正常,排除自身免疫性疾病、感染和腫瘤等存在免疫炎癥的患者。兩組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

表1 中毒組和對照組年齡、性別比較Table 1 Comparison of gender and age between poisoning group and control group

1.2 主要試劑和儀器

Anti-humanCD4-PerCP、anti-humanCD279(PD-1)APC、anti-humanCD274(PD-L1)-PE熒光素標(biāo)記單克隆抗體及其Mouse IgG1同型對照抗體、紅細(xì)胞裂解液、去離子水均購自Biolegend公司;流式細(xì)胞檢測儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.3 外周血CD4+T淋巴細(xì)胞PD-1及PD-L1表達(dá)檢測

晨起取空腹外周靜脈血3 ml,肝素抗凝。全血100 μl分別加入小鼠抗人CD4-PerCP、抗PD-1-APC和抗PD-L1-PE單克隆抗體5 μl,4 ℃避光環(huán)境下孵育20 min,加入10倍稀釋后的紅細(xì)胞裂解液2 ml,室溫避光靜置15 min。待紅細(xì)胞完全溶血后,離心后加入PBS緩沖液,重復(fù)洗滌3次。再加入PBS300 μl,立刻上流式細(xì)胞儀檢測,應(yīng)用BD CellQuest軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 血清TNF-ɑ及IL-10檢測

晨起取血6 ml,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝、靜置30 min后,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,分離血漿及血清,-70 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒檢測血清中TNF-ɑ和IL-10的表達(dá)水平。操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測外周血單個核細(xì)胞PD-1及PD-L1蛋白表達(dá)

應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離新鮮抗凝血中的PMBC,分離出的細(xì)胞PBS清洗2次,加入RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min,4 ℃ 14 000 r/min離心15 min,收集上清液并采用BCA法測定蛋白濃度,然后將適量細(xì)胞總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進(jìn)行分離,并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,電轉(zhuǎn)后的膜在含5%BSA的封閉液中室溫封閉1 h。使用PD-1、PD-L1一抗4 ℃孵育過夜,PBS清洗3次,然后使用HRP標(biāo)記的二抗稀釋液室溫孵育1.5 h,PBS洗3次。經(jīng)凝膠分析系統(tǒng)曝光,將膠片進(jìn)行掃描存檔,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 外周血CD4+T細(xì)胞PD-1及PD-L1表達(dá)水平比較

中毒后各觀察點CD4+T細(xì)胞PD-1分子陽性率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),組間比較顯示中毒后24 h、72 h較對照組均顯著升高(P<0.01),120 h恢復(fù)正常(P>0.05,見圖1,表2)。中毒后各觀察點CD4+T細(xì)胞PD-L1分子陽性率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),組間比較顯示:中毒后24 h、72 h、120 h較對照組PD-L1分子陽性率均顯著升高,PQ中毒后24 h CD4+T細(xì)胞PD-L1分子表達(dá)明顯升高,且持續(xù)到中毒后120 h(P<0.05,見圖2,表2)。實驗結(jié)果提示中毒后CD4+T細(xì)胞PD-1/PD-L1信號通路處于明顯激活狀態(tài)。

圖1 中毒組與對照組外周血CD4+T細(xì)胞PD-1表達(dá)流式散點圖比較Figure 1 Comparison of PD-1expression in CD4+T lymphocyte between poisoning group and control group

圖2 中毒組與對照組外周血CD4+T細(xì)胞PD-L1表達(dá)流式散點圖比較Figure 2 Comparison of the PD-L1expression in CD4+T lymphocyte between poisoning group and control group

表2 中毒組與對照組外周血CD4+T細(xì)胞PD-1和PD-L1表達(dá)水平比較 (%,Table 2 Comparison of PD-1 and PD-L1 expression in CD4+T lymphocyte between poisoning group and control group (%,

2.2 TNF-ɑ及IL-10檢測結(jié)果比較

中毒組和對照組血清TNF-ɑ及IL-10濃度比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。組間比較:中毒24 h與對照組比較,血清TNF-ɑ及IL-10濃度明顯升高(P<0.05),72 h與對照組比較仍維持在較高水平(P<0.05),120 h與對照組比較,血清TNF-ɑ及IL-10濃度無明顯差異(P>0.05,見表3)。

表3 中毒組與對照組血清TNF-ɑ和IL-10比較 (pg/L)Table 3 Comparison of serum TNF-ɑ and IL-10 levels among four groups (pg/L)

2.3 外周血單個核細(xì)胞PD-1及PD-L1蛋白表達(dá)

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:中毒后各24 h,72 h,120 h外周血單個核細(xì)胞PD-1及PD-L1目標(biāo)條帶灰度與對照組比較明顯增高(見圖3A),通過將目標(biāo)條帶灰度和內(nèi)參條帶灰度比值進(jìn)行比較,中毒后24 h,72 h,120 h外周血單個核細(xì)胞PD-1蛋白表達(dá)在中毒后表達(dá)明顯升高(P<0.05,見圖3B),PD-L1表達(dá)也呈現(xiàn)相同的趨勢(P<0.05,見圖3C)。

A.Western blot結(jié)果 B.PD-1相對表達(dá)量比較 C.PD-L1相對表達(dá)量比較

3 討論

百草枯口服吸收后廣泛分布并損害體內(nèi)多種器官[4]。PQ進(jìn)入器官后,機(jī)體針對毒物會產(chǎn)生免疫反應(yīng)[5],免疫反應(yīng)被認(rèn)為在PQ中毒發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[6]。

T細(xì)胞免疫是細(xì)胞免疫的重要組成部分,免疫激活后,T細(xì)胞通過識別、增殖與活化對病原體進(jìn)行殺傷與吞噬,同時介導(dǎo)細(xì)胞因子釋放調(diào)理免疫[7]。PQ中毒急性期,機(jī)體即釋放由CD4+T細(xì)胞所分泌的腫瘤壞死因子α等炎性細(xì)胞因子[8]。它們不僅能促使炎性細(xì)胞浸潤、分化和成熟,還能導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的進(jìn)一步分泌和表達(dá),從而形成龐大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),影響宿主的免疫能力,最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭[9]。

PD-1/PD-L1是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵負(fù)性共刺激分子,能夠引起T細(xì)胞停滯于G0/G1期,顯著抑制T細(xì)胞的生物學(xué)功能,調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)程度[10]。PD-1表達(dá)廣泛,在外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面活化后廣泛誘導(dǎo)表達(dá)[3]。PD-L1是PD-1的主要配體,主要在CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá),PD-1通過與其配體結(jié)合抑制T淋巴細(xì)胞的功能,從而抑制自身免疫應(yīng)答[11]。研究證實PD-1及其配體信號通路通過干擾CD28介導(dǎo)PI3K的激活抑制Akt磷酸化,發(fā)揮抑制T細(xì)胞存活及增殖、減少細(xì)胞因子合成的作用[12]。本實驗中檢測的TNF-ɑ和IL-10是CD4+T淋巴細(xì)胞的重要下游分子,百草枯中毒后明顯升高[13],其中TNF-α是中毒導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)的始動因子,與患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有一定相關(guān)性[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒患者外周血CD4+T細(xì)胞PD-1、PD-L1陽性率較對照明顯升高,且持續(xù)升高到中毒后72 h;蛋白免疫印跡實驗顯示:外周血單個核細(xì)胞PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)在各觀察點較對照組明顯升高。而血清炎性細(xì)胞因子TNF-ɑ和IL-10在中毒后24 h達(dá)到高峰,此后逐漸下降,中毒后120 h時與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示,PQ進(jìn)入人體后會激活T細(xì)胞免疫,分泌炎性細(xì)胞因子。同時CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1陽性率明顯上升,PD-1/PD-L1信號通路激活,抑制T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,導(dǎo)致血清TNF-ɑ和IL-10濃度降低。本研究納入患者口服中毒量較小,預(yù)后較好。我們認(rèn)為PD-1/PD-L1信號通路在中毒后激活,在少量百草枯中毒患者病情好轉(zhuǎn)中發(fā)揮了一定的自我保護(hù)作用。隨著患者中毒量的增大,PD-1/PD-L1信號通路雖不足以整體抑制T細(xì)胞免疫激活,無法阻止病情惡化,但作為自身免疫和感染性疾病慢性化的重要影響因素[15],其高表達(dá)可能導(dǎo)致T細(xì)胞處于持續(xù)功能抑制,影響機(jī)體免疫狀態(tài),與中毒后繼發(fā)感染、疾病的遷延不愈有一定的關(guān)系,其作用機(jī)制值得在臨床治療中予以關(guān)注。