黃亞醫(yī),黃 婷,王雅楓,趙 博,周 芳,肖業(yè)達(dá)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060;*通訊作者,E-mail:xiaoyeda008@126.com)

缺血再灌注損傷是圍手術(shù)期急性腎損傷的主要病因,而糖尿病狀態(tài)下機(jī)體處于高氧化應(yīng)激和強(qiáng)炎癥反應(yīng)狀態(tài),導(dǎo)致大量氧自由基和炎癥因子的生成與釋放,從而誘發(fā)臟器產(chǎn)生更為嚴(yán)重的缺血再灌注損傷[1,2]。

Toll樣受體家族(TLRs)是近年來識(shí)別病原微生物、啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)的重要受體蛋白。其下游的髓樣分化因子88(MyD88),可觸發(fā)除TLR3以外所有Toll樣受體對(duì)NF-κB的激活[3-5]。Assmann等[6]學(xué)者推測(cè)TLRs可能是觸發(fā)1型糖尿病的機(jī)制之一。TLRs作為識(shí)別模式家族重要成員,促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞識(shí)別不同病原菌影響促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[7]。TLRs過度激活可能導(dǎo)致自發(fā)免疫反應(yīng)過度反應(yīng)[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)呼吸道合胞病毒感染A549細(xì)胞后,TLR7及其下游蛋白表達(dá)增強(qiáng),使炎性細(xì)胞因子釋放增加,也加劇氧化應(yīng)激[9]。本研究擬評(píng)價(jià)高糖環(huán)境下TLR7/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在HK-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用,為臨床降低糖尿病患者圍術(shù)期腎缺血再灌注損傷的發(fā)病率提供理論基礎(chǔ),為糖尿病急性腎損傷提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(ATCC,美國(guó)),DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone,美國(guó)),CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),LDH測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所),SOD測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所)及MDA測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所),IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(伊萊瑞特,中國(guó)),兔抗TLR7抗體(Novus Biologicals,美國(guó)),兔抗MyD88抗體(Abcam,英國(guó)),兔抗NF-κB抗體(CST,美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

高糖模型的建立:當(dāng)HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)到70%-80%,用含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞,吹打并傳代。鋪板用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基同步化24 h加入高糖(葡萄糖終質(zhì)量濃度30 mmol/L)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h。采用隨機(jī)數(shù)字表法將HK-2細(xì)胞分為:高糖組(HG組),高糖缺氧復(fù)氧組(HH/R組),高糖缺氧復(fù)氧+TLR7基因沉默組(HH/R-siRNA組)。HH/R組進(jìn)行缺氧4 h,復(fù)氧2 h處理建立缺氧復(fù)氧模型。HH/R-siRNA組在siRNA轉(zhuǎn)染成功后48 h高糖缺氧復(fù)氧模型操作[10]。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中,并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,鋪板;轉(zhuǎn)染前2 h,換成無血清的DMEM培養(yǎng)基;將100 μl無血清opti-DMEM稀釋10 μl siRNA,用槍頭輕輕混勻,室溫下靜置5 min待用;使用前輕輕混勻LipofectamineTM2000,然后取5 μl的LipofectamineTM2000稀釋在100 μl opti-DMEM中,室溫下靜置5 min;將LipofectamineTM2000和siRNA的稀釋液[TLR7 siRNA(h):sc-40266,Santa Cruz Biotechnology, Inc.; TLR7-sense(S):5′-GAGGAAUUAGACAU CUCUAdTdT-3′;TLR7-antisense(AS):5′-UAGAGAUGUCUAAUU CCUCdTdT-3′]輕輕混勻,充分混勻后,于室溫(15-25 ℃)下放置3 min,使轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。室溫下6 h內(nèi)不會(huì)失效;每個(gè)培養(yǎng)孔加混合液200 μl,小心搖動(dòng)培養(yǎng)板以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻地分布于單層細(xì)胞表面;細(xì)胞送返培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 h后吸出混合液換入完全培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用Western blotting法測(cè)定TLR7蛋白含量,計(jì)算質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率,轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行下一步操作。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

根據(jù)試劑說明書,酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞CCK-8,LDH。分別按照SOD和MDA試劑盒說明書檢測(cè)SOD和MDA。ELISA法檢測(cè)IL-6和TNF-α。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,收集細(xì)胞1 000 r/min離心5 min,棄上清。沉淀用500 μl緩沖液重懸,加入5 μl Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素和10 μl碘化丙錠,室溫避光孵育5 min后用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。采用Western blotting法測(cè)定目的蛋白濃度:采用SDS聚丙烯酰胺凝膠上樣凝膠電泳。蛋白冰浴轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉室溫封閉1-2 h。加入抗TLR7(1 ∶500)、抗MyD88(1 ∶600)和NF-κB(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。次日用辣根過氧化氫酶標(biāo)記的二抗(抗兔,1 ∶5 000)孵育1 h后用TBST清洗,顯色曝光,以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值反映目的蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

TLR7-siRNA組和空白對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞48 h后對(duì)TLR7蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示,TLR7-siRNA組與空白對(duì)照組比較,TLR7表達(dá)被有效抑制(P<0.05,見圖1),TLR7-siRNA轉(zhuǎn)染率為72.56%。

2.2 不同組別CCK-8、LDH、SOD、MDA、IL-6和TNF-α的變化

與HG組相比,HH/R組CCK-8和SOD活性下降,LDH、MDA、IL-6和TNF-α表達(dá)增多(P<0.05);與HH/R組相比,HH/R-siRNA組CCK-8和SOD活性上升,LDH、MDA、IL-6和TNF-α表達(dá)減少(P<0.05,見表1)。

2.3 HK-2細(xì)胞的凋亡情況比較

與HG組相比,HH/R組細(xì)胞凋亡率增多(P<0.05);與HH/R組相比,HH/R-siRNA組細(xì)胞凋亡率減少(P<0.05,見圖2,3)。

與空白對(duì)照組相比,*P<0.05

表1 三組HK-2細(xì)胞CCK-8、LDH、SOD、MDA、IL-6和TNF-α比較Table 1 Comparison of CCK-8, LDH, SOD, MDA, IL-6 and TNF-α in HK-2 cells among three

圖2 三組HK-2細(xì)胞的凋亡情況 (n=6)Figure 2 Apoptosis of HK-2 cells in three groups by flow cytometry (n=6)

與HG組比較,#P<0.05;與HH/R組比較,*P<0.05

2.4 Western blotting分析HK-2細(xì)胞中TLR7、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)

與HG組相比,HH/R組TLR7、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)增多(P<0.05);與HH/R組相比,HH/R-siRNA組TLR7、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)減少(P<0.05,見圖4)。

3 討論

糖尿病是一種器官特異性自身免疫性疾病,其中大部分β細(xì)胞被細(xì)胞毒性T細(xì)胞所破壞[11]。TLRs作為一類重要的傳感器,在天然性免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮極其重要作用[12]。因此有學(xué)者認(rèn)為Toll樣受體的激活在導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)的同時(shí)也可能是觸發(fā)糖尿病的機(jī)制之一。

與HG組比較,#P<0.05;與HH/R組比較,*P<0.05

研究認(rèn)為TLRs參與MyD88依賴的信號(hào)通路,激活NF-κB,從而導(dǎo)致炎性因子的大量釋放。糖尿病狀態(tài)下機(jī)體處于高氧化應(yīng)激和強(qiáng)炎癥反應(yīng)狀態(tài),導(dǎo)致大量氧自由基和炎癥因子的生成與釋放,從而誘發(fā)臟器產(chǎn)生更嚴(yán)重的缺血再灌注損傷[16,17]。本研究結(jié)果表明:高糖狀態(tài)下,HK-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧后CCK-8和SOD活性下降,LDH、MDA、IL-6和TNF-α表達(dá)增多,導(dǎo)致細(xì)胞活性下降,氧化應(yīng)激增強(qiáng),炎癥反應(yīng)的爆發(fā),細(xì)胞凋亡增多;而給與TLR7基因沉默后,部分氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)被抑制,凋亡減少,與信號(hào)通路的變化趨勢(shì)相一致。

TLRs作為先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中起到觸發(fā)作用。數(shù)據(jù)表明,TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路與糖尿病、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟的疾病密切相關(guān)。同時(shí)TLRs參與了腎病的發(fā)病機(jī)制,可能與腎缺血再灌注損傷有關(guān)[13,14]。TLRs可協(xié)同其相關(guān)信號(hào)分子,激活細(xì)胞因子表達(dá),從而參與免疫應(yīng)答引起的腎損傷。過度激活TLRs后會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體損傷[15]。

TLR7蛋白通過活化MyD88依賴性途徑激活NF-κB,觸發(fā)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生,導(dǎo)致IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)、TNF受體關(guān)聯(lián)因子6(TRAF6)和TGF-β活化激酶1(TAK1)的激活[18]。本研究結(jié)果表明:高糖狀態(tài)下,HK-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧后TLR7、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)增多,細(xì)胞損傷加重;同樣條件下,TLR7-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)均下降,細(xì)胞凋亡減輕,細(xì)胞活性增加。由此推測(cè),高糖狀態(tài)下,缺氧復(fù)氧使HK-2細(xì)胞TLR7蛋白上調(diào),啟動(dòng)TLR7/MyD88/NF-κB信號(hào)通路,加重HK-2細(xì)胞損傷。過度活化TLR7/MyD88/NF-κB信號(hào)通路也許是加重HK-2細(xì)胞損傷機(jī)制之一。抑制TLR7表達(dá)后,阻斷TLR7/MyD88/NF-κB信號(hào)通路,使MyD88和NF-κB的蛋白表達(dá)下調(diào),細(xì)胞損傷減輕。由此得出,TLR7在HK-2細(xì)胞高糖缺氧復(fù)氧損傷機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

TLR7在糖尿病急性腎損傷中發(fā)揮的作用正逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。我們的研究證明在高糖環(huán)境下,TLR7/MyD88/NF-κB信號(hào)通路參與HK-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷。抑制TLR7表達(dá)可以減輕缺氧復(fù)氧引起的細(xì)胞毒性損傷,降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,減輕缺氧復(fù)氧損傷,從而為糖尿病急性腎損傷的臨床治療提供新的切入點(diǎn)。