李 楠,徐 靜,成淑英,王 翔,農(nóng)晰婷

(1西安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710004;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail:xujingjdey85@163.com)

2型糖尿病、肥胖、胰島素抵抗三者密切相關(guān),而肥胖合并2型糖尿病患者常伴發(fā)脂肪肝[1]。目前對(duì)于2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus disease,T2DM)合并非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程仍未能完全明確,可能與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、能量代謝等密切關(guān)聯(lián),但確切機(jī)制尚未明確。Sirt1是一種與代謝有關(guān)的基因,能夠調(diào)節(jié)能量代謝、眾多基因的轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞衰老,它是一種保守的煙酰腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)的組蛋白/非組蛋白去乙?；竅2]。UCP2是線粒體內(nèi)膜的蛋白之一,它能將機(jī)體代謝作用于合成ATP的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃?并對(duì)機(jī)體能量平衡涉及的體質(zhì)量、靜止代謝率和食物轉(zhuǎn)化效率等性狀具有顯著的影響[3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SIRT1、UCP2與機(jī)體代謝關(guān)系的研究較多,它們參與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病等代謝性疾病的病理過(guò)程及機(jī)體能量和物質(zhì)代謝平衡的調(diào)節(jié),但有關(guān)SIRT1、UCP2在T2DM合并NAFLD中的表達(dá)研究及藥物干預(yù)方面的報(bào)道較少。且吡格列酮作為胰島素增敏劑改善胰島素抵抗作用研究頗多,也有報(bào)道其參與改善脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展及抵抗炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)作用,但其作用于T2DM合并NAFLD方面的具體研究仍較少。本研究主要通過(guò)吡格列酮的干預(yù),分析T2DM合并NAFLD大鼠SIRT1、UCP2表達(dá)變化,探討吡格列酮對(duì)T2DM合并NAFLD治療的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立及分組

8周齡雄性SD大鼠60只,清潔級(jí),體質(zhì)量198-225 g,購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境,溫度18-26 ℃,濕度50%-60%。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和吡格列酮組。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),模型組給予高脂及高糖飼料喂養(yǎng)(基礎(chǔ)飼料82%,豬油10%,蔗糖5%,膽酸鈉0.5%,膽固醇2.5%),制成顆粒料,控溫烘干。第12周末,模型組大鼠空腹時(shí)腹腔注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)[4],對(duì)照組腹腔注射同樣體積的檸檬酸緩沖液。抽取模型組大鼠經(jīng)10%的水合氯醛麻醉后取肝臟行病理學(xué)形態(tài)觀察,肝臟有明顯的脂肪變性,并且胞質(zhì)內(nèi)存在大量脂滴空泡,需連續(xù)兩次以上測(cè)得大鼠的空腹血糖≥7.8 mmol/L[5],合并胰島素抵抗者,確定為2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型。第15周時(shí),依據(jù)大鼠體質(zhì)量,參照人與大鼠每千克體質(zhì)量等效劑量折算系數(shù),計(jì)算大鼠給藥劑量,吡格列酮組給予吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃[6],正常對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,藥物干預(yù)共持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)中1只大鼠被隨機(jī)選做肝臟病理切片,觀察造模成功情況,1只大鼠造模不成功,3只大鼠灌胃期間死亡,共有55只大鼠完成全部實(shí)驗(yàn)(共22周)。

1.2 主要試劑與儀器

主要有鏈脲佐菌素(Sigma,美國(guó)),游離脂肪酸試劑盒(RANDOX,英國(guó)),胰島素檢測(cè)試劑盒(R&D,美國(guó)),全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)7170,日本日立公司),SIRT1、UCP2兔抗大鼠多克隆抗體(北京博奧森生物有限公司),real-time PCR試劑盒(Fermentas,加拿大),PCR儀(BIO-RAD,美國(guó)),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國(guó))。

1.3 血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束(22周末)時(shí)使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、游離脂肪酸(FFAs);ELISA法測(cè)定空腹胰島素(FINs)。

1.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

大鼠經(jīng)10%的水合氯醛麻醉,取肝組織,10%甲醛固定;常規(guī)石蠟包埋,切片、HE染色,中性樹(shù)膠封片,光鏡,觀察各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)SIRT1、UCP2的表達(dá)

石蠟切片脫蠟至水;3% H2O2室溫孵育5-10 min;蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min;滴加5%-10%正常的山羊血清封閉,室溫孵育10 min;滴加一抗(SIRT1、UCP2稀釋濃度均為1 ∶100),4 ℃過(guò)夜;PBS洗5 min×3次;滴加二抗,37 ℃孵育10-30 min;PBS沖洗,5 min×3次;滴加適量的堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37 ℃孵育10-30 min;PBS洗5 min×3次;顯色劑顯色3-15 min;行自來(lái)水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明,最后封片。陰性對(duì)照選用PBS,陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,分別測(cè)定SIRT1及UCP2的平均積分光密度值(AIOD)。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SIRT1、UCP2的表達(dá)

Fast法提取肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)肝組織SIRT1及UCP2 mRNA表達(dá)水平?；蛞锏男蛄蟹謩e為:SIRT1上游:5′-TCATTCCTGTGAAAGTGATGACGA-3′,下游:5′-CTGCCACAGTGTCATATCATCCAA-3′,序列號(hào):NM-012238.4,長(zhǎng)度為196 bp。UCP2上游:5′-GCTGGTGACCTATGACCTCAT CAA-3′,下游:5′-GTACTGGCCCAAGGCAGAGTTC-3′,序列號(hào):NM-003355.2,長(zhǎng)度為172 bp。內(nèi)參β-actin上游:5′-GGAGATTA CTGCCCTGGCTCCTA-3′,下游:5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC TG-3′,序列號(hào):NM-005159.4,長(zhǎng)度為150 bp。循環(huán)條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán),使用相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組血清學(xué)指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),模型組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、FFAs、FINs均較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05);吡格列酮組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、FFAs、FINs均較模型組減低,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of serum markers at the end of experiment between three

2.2 大鼠肝組織病理學(xué)改變

染色后,通過(guò)光鏡觀察到對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,并且結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠肝細(xì)胞高度氣球樣變及脂肪變性,胞質(zhì)中有大量脂滴空泡,均為中至重度脂肪肝。吡格列酮組大鼠肝組織與正常對(duì)照組相比較,仍可見(jiàn)輕至中度氣球樣變及脂肪變性,但與模型組比較,氣球樣變及脂肪變性程度均減輕,胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少,同時(shí)細(xì)胞體積縮小,炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和壞死灶也相對(duì)縮小(見(jiàn)圖1)。

A.正常對(duì)照組 B.模型組 C.吡格列酮組

2.3 免疫組化SIRT1、UCP2的表達(dá)結(jié)果

圖片中被染色的SIRT1、UCP2陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒,結(jié)果顯示:模型組SIRT1表達(dá)的AIOD值較正常對(duì)照組明顯減少(P<0.05),吡格列酮組SIRT1表達(dá)的AIOD值較模型組增加(P<0.05);而模型組UCP2表達(dá)的AIOD值較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.05),吡格列酮組UCP2表達(dá)的AIOD值較模型組減少(P<0.05,見(jiàn)表2,圖2)。

表2 各組SIRT1、UCP2 AIOD的比較Table 2 Comparison of SIRT1, UCP2 AIOD between three

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SIRT1 mRNA、UCP2 mRNA的結(jié)果

模型組SIRT1 mRNA表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);吡格列酮組SIRT1 mRNA表達(dá)顯著高于模型組(P<0.05);而模型組UCP2 mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05);吡格列酮組UCP2 mRNA表達(dá)顯著低于模型組(P<0.05,見(jiàn)表3)。

A.正常對(duì)照組SIRT1表達(dá);B.模型組SIRT1表達(dá);C.吡格列酮組SIRT1表達(dá);D.正常對(duì)照組UCP2表達(dá);E.模型組UCP2表達(dá);F.吡格列酮組UCP2表達(dá)

表3 各組SIRT1、UCP2 mRNA表達(dá)的比較Table 3 Comparison of SIRT1, UCP2 mRNA between three

3 討論

隨著2型糖尿病、非酒精性脂肪肝發(fā)病率的不斷增加,目前認(rèn)為胰島素抵抗是引起非酒精性脂肪肝的重要原因之一。本研究通過(guò)對(duì)大鼠喂養(yǎng)高脂高糖飲食及小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射法成功地建立T2DM合并NAFLD大鼠模型,T2DM合并NAFLD大鼠在實(shí)驗(yàn)中血糖升高,血脂、轉(zhuǎn)氨酶及游離脂肪酸均升高,產(chǎn)生明顯的胰島素抵抗。肝臟病理結(jié)果顯示肝組織出現(xiàn)明顯的脂肪變性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化法觀察到T2DM合并NAFLD組大鼠肝臟SIRT1的表達(dá)較正常對(duì)照組減低,UCP2的表達(dá)較正常對(duì)照組增加;real time-PCR法對(duì)T2DM合并NAFLD組大鼠肝臟SIRT1、UCP2在mRNA水平上的表達(dá)變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì),SIRT1 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組降低,UCP2 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組增加,表明SIRT1與UCP2的異常表達(dá)可能在T2DM合并NAFLD起著關(guān)鍵作用。有研究表明SIRT1通過(guò)PGC1-α通路促進(jìn)糖異生相關(guān)基因的表達(dá)并抑制著糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),而SIRT1的活性受到NAD+影響,因此SIRT1極有可能是通過(guò)感知肝細(xì)胞中的NAD+水平的方法,來(lái)發(fā)揮調(diào)控機(jī)體葡萄糖代謝及營(yíng)養(yǎng)平衡功能的作用[7]。在長(zhǎng)期高脂高糖飲食狀態(tài)下,通過(guò)熱卡限制使動(dòng)物SIRT1的蛋白表達(dá)水平不斷增高,可以改善肝臟的脂肪變性和促進(jìn)其合理的能量代謝[8]。本研究表明UCP2 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組增加,有學(xué)者提出UCP2的表達(dá)可能與胰島素抵抗、對(duì)ATP合成的調(diào)控相關(guān)聯(lián)[9]。T2DM合并NAFLD時(shí)存在明顯IR、FFAs升高、轉(zhuǎn)氨酶增高及糖、脂代謝紊亂,通過(guò)產(chǎn)生的高胰島素血癥、糖脂毒性致使SIRT1表達(dá)下調(diào)及其活性減低[10],未能有效地改善肝臟脂質(zhì)沉積,進(jìn)一步促進(jìn)脂肪肝的發(fā)展。IR的存在、FFAs升高及脂質(zhì)代謝的紊亂,使得肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1表達(dá)下調(diào),失去了對(duì)UCP2的抑制,進(jìn)而UCP2表達(dá)可以增強(qiáng)。誘導(dǎo)UCP2上調(diào)表達(dá),可能是機(jī)體的一種適應(yīng)性反應(yīng),但是UCP2的過(guò)度表達(dá),使其活性增加,氧化磷酸化解偶聯(lián)作用增強(qiáng),ATP合成作用下降,同時(shí)ATP過(guò)度的消耗,使得肝細(xì)胞對(duì)于壞死顯得尤為敏感[11]。

PPAR-γ作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,在脂肪形成和堆積時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)特殊的脂肪基因表達(dá)來(lái)改善脂類(lèi)物質(zhì)的代謝,同時(shí)也操控著更多的中間型轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。SIRT1表達(dá)受限,有可能造成與NcoR和視黃酸及SMRT相互作用減弱,抑制PPAR-γ的作用被解除[12],脂肪動(dòng)員受阻,繼而出現(xiàn)明顯的肝臟脂肪變。NAFLD中的肝細(xì)胞UCP2表達(dá)增強(qiáng)可能與氧化應(yīng)激增強(qiáng)、高脂飲食、FFAs增多、胰島素抵抗等諸多因素密切相關(guān),NAFLD時(shí)UCP2基因在肝細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)有增加,對(duì)機(jī)體能量和物質(zhì)代謝平衡起重要的調(diào)節(jié)作用,但同時(shí)在機(jī)體受損傷時(shí),它也是主要的靶組織。有研究表明PPAR-γ被活化后,可通過(guò)阻止胰島細(xì)胞中UCP2表達(dá)的增加,從而使基礎(chǔ)胰島素水平保持平穩(wěn),以及胰島素分泌水平保持正常[13]。吡格列酮通過(guò)與PPAR-γ核受體轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而改善胰島素敏感性,它不僅可以抑制肝臟脂肪沉積及肝細(xì)胞損傷,而且可以改善肝纖維化。近年來(lái)對(duì)吡格列酮改善脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展及抵抗炎性細(xì)胞浸潤(rùn)作用的研究有了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),包括改善脂肪組織中胰島素的敏感性,減輕肝細(xì)胞的脂肪堆積;選擇性地作用于PPAR-γ,調(diào)節(jié)葡萄糖、脂類(lèi)代謝,更好地減輕胰島素抵抗等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予大鼠行吡格列酮治療后,該組大鼠血脂、血糖、肝功、胰島素水平、游離脂肪酸水平均較模型組改善,肝臟病理顯示脂肪變性減輕。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以促進(jìn)SIRT1表達(dá),同時(shí)降低UCP2表達(dá)。這可能與PPAR-γ可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)肝臟SIRT1、UCP2的表達(dá)有關(guān)。但它們?nèi)绾卧赥2DM合并NAFLD發(fā)生、發(fā)展中起作用尚不清楚,有待于更進(jìn)一步的研究。

綜上所述,關(guān)于T2DM合并NAFLD的發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步探討,本實(shí)驗(yàn)樣本量局限,SIRT1、UCP2的研究結(jié)果可能受到影響,但是本研究對(duì)T2DM合并NAFLD的藥物治療方面可能會(huì)有一定程度的啟示作用,有可能會(huì)對(duì)該疾病的治療帶來(lái)新發(fā)現(xiàn)。