賈艷梅,陳利榮#,李元宏,郭松佳

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,汾陽(yáng) 032200;2山西省人民醫(yī)院腎臟病分子診斷與治療實(shí)驗(yàn)室;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:jym928@163.com)

結(jié)腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤疾病[1,2]。目前,腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移仍然是癌癥患者的發(fā)病率和死亡率居高不下的主要原因[3,4]。因此,了解腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制有助于結(jié)腸癌的有效治療。

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征,是絕大多數(shù)腫瘤患者的致死因素。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移由一系列復(fù)雜而連續(xù)的步驟所組成,其中遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié),腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)或體外的遷移能力與其轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性,因此通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能夠有效地控制腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞通過(guò)去分化由多邊形上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮伍g葉性細(xì)胞形態(tài),稱(chēng)為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT),使得腫瘤細(xì)胞更具運(yùn)動(dòng)能力,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移。E-cadherin的表達(dá)下降,同時(shí)N-cadherin表達(dá)上升,是腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生的標(biāo)志[5,6],一些轉(zhuǎn)錄因子,如Snail-1,Snail-2和LEF-1等能夠抑制E-cadherin并促進(jìn)N-cadherin的表達(dá)[7-9]。

自噬(autophagy)是指細(xì)胞自身從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。微管相關(guān)蛋白3(LC3)是自噬標(biāo)志物,自噬形成時(shí),胞漿型LC3(LC3-Ⅰ)會(huì)被酶降解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?即LC3-Ⅱ),LC3-Ⅱ被認(rèn)為是自噬過(guò)程的特征蛋白[10,26],LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬體的數(shù)量成正相關(guān)[11]。泛素結(jié)合蛋白P62(也稱(chēng)為SQSTM1蛋白)偶聯(lián)于LC3,作為一種調(diào)節(jié)因子參與自噬體的構(gòu)成,細(xì)胞內(nèi)整體p62水平的表達(dá)與自噬活性呈負(fù)相關(guān)性[12]。有研究表明,自噬在腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中具有雙向作用[13,14],哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是自噬發(fā)生重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子,其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[15,16,24]。mTOR對(duì)細(xì)胞自噬起負(fù)向調(diào)控作用[17],有研究顯示,mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)可能通過(guò)激活自噬來(lái)達(dá)到抗腫瘤作用[18]。本研究利用RAPA作用于人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞,觀察其誘導(dǎo)的自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)買(mǎi)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen(Carlsbad,CA);胰蛋白酶購(gòu)買(mǎi)自中生華美北京科技有限公司;青鏈霉素購(gòu)買(mǎi)自武漢博士德公司;Rapamycin,P62,氯喹(chloroquine,CQ)購(gòu)買(mǎi)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;RNAiso Plus,PrimeScript RT MasterMix and SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)買(mǎi)自Takara(Shiga,Japan);E-cadherin抗體購(gòu)買(mǎi)自Sino Biological, Inc.(Beijing,China);N-cadherin抗體購(gòu)買(mǎi)自Bioworld Technology(Minneapolis,MN);Snail-1抗體購(gòu)自武漢三鷹;LC3抗體購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma公司;GAPDH抗體購(gòu)買(mǎi)自Abmart(Shanghai,China);HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen(Carlsbad,CA),fluorescence-conjugated secondary antibody(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO,USA)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29為山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院學(xué)院科技中心保存,常規(guī)培養(yǎng)于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2及95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將HT29細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(50nmol/LRAPA處理24 h)和對(duì)照組。

1.3 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞自噬

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別用甲醇于4 ℃固定60 min。PBS清洗2次,載玻片用0.2% Triton X-100浸泡5 min,LC3抗體于4 ℃過(guò)夜孵育。PBS清洗2次,細(xì)胞用綠色熒光標(biāo)記的二抗室溫下孵育90 min。PBS清洗兩次,4 ℃,DAPI避光染色1 h。PBS清洗去除DAPI,免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核及LC3-labeled自噬小體。計(jì)數(shù)每組含有自噬小體的平均數(shù),每個(gè)樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

將HT-29細(xì)胞接種于24孔板,直至長(zhǎng)成單層細(xì)胞。用無(wú)菌槍頭在單層細(xì)胞中央劃一直線,PBS清洗2次,倒置顯微鏡照相。用無(wú)血清的RPMI-1640孵育對(duì)照組細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞添加RAPA,使其終濃度為50 nmol/L,RAPA處理24 h后照相。同時(shí)設(shè)立RAPA和自噬抑制劑氯奎(CQ)聯(lián)合處理組(50 nmol/L RAPA,5 nmol/L CQ共同處理24 h)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,計(jì)算劃痕愈合率,公式為劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.5 Quantitative real-time PCR檢測(cè)遷移相關(guān)分子mRNA的表達(dá)

Trizol法提取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞總RNA。將500 ng RNA用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用2×SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行quantitative real-time PCR(qPCR),qPCR的條件為:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;64 ℃,34 s,40 cycles。反應(yīng)結(jié)束后,確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線。GAPDH作為內(nèi)參基因,GAPDH和目標(biāo)基因Ct值的不同作為每個(gè)樣品相對(duì)表達(dá)分析的基礎(chǔ),相對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)用ΔΔCt方法分析處理。RT-PCR引物為見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primer sequences

1.6 Western blot檢測(cè)分析自噬蛋白表達(dá)情況

用0.25%胰蛋白酶消化收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的HT29細(xì)胞,加裂解液提取蛋白,經(jīng)BCA法蛋白定量后,將樣品和5×loading buffer沸水浴5 min使蛋白變性,進(jìn)行10% SDS-PAGE中凝膠電泳,每孔蛋白上樣量保持一致。取適量樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加入p62抗體(1 ∶1 000)、LC3抗體(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)抗體、N-cadherin抗體(1 ∶1 000)、Snail-1(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000),室溫孵育2 h,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光液顯像。Image J軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光分析HT29細(xì)胞自噬發(fā)生結(jié)果

經(jīng)RAPA處理后,用帶有綠色熒光的LC3標(biāo)記自噬小體來(lái)檢測(cè)HT29細(xì)胞自噬發(fā)生的情況見(jiàn)圖1,與對(duì)照組相比,RAPA組細(xì)胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)(綠色)的數(shù)量顯著增加。鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞所含的自噬小體數(shù),每組隨機(jī)選擇100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算平均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。每個(gè)細(xì)胞平均含有的自噬小體數(shù)分別為:對(duì)照組(9.0±0.5)個(gè)和RAPA組(21.2±0.2)個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.免疫熒光顯微鏡下觀察自噬小體的形成B.鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞所含的自噬小體數(shù)

2.2 RAPA誘導(dǎo)自噬與HT29細(xì)胞遷移能力的關(guān)系

本組結(jié)果顯示,RAPA處理24 h時(shí)細(xì)胞發(fā)生顯著自噬,因此我們選取RAPA處理24 h組為研究對(duì)象。RAPA實(shí)驗(yàn)組、RAPA和CQ聯(lián)合處理組處理24 h,劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)RAPA處理的HT29細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,與空白對(duì)照組及聯(lián)合處理組相比,RAPA組向劃痕處遷移程度最小,劃痕距離最寬,且遷移速度顯著慢于空白對(duì)照組(P<0.01,見(jiàn)圖2)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RAPA誘導(dǎo)自噬可抑制HT29細(xì)胞的遷移能力。

A.劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況 B.各組細(xì)胞的劃痕愈合率比較

2.3 qPCR檢測(cè)細(xì)胞自噬抑制遷移的相關(guān)mRNA表達(dá)結(jié)果

qPCR結(jié)果顯示,Snail-1 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.01),而Snail-2和LEF-1無(wú)顯著變化,同時(shí)E-cadherin mRNA表達(dá)水平升高,N-cadherin mRNA表達(dá)水平降低(見(jiàn)圖3A,P<0.01),Western blotting結(jié)果與之相符(見(jiàn)圖3B)。結(jié)果表明,RAPA誘導(dǎo)的自噬可能是通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail-1,進(jìn)而促進(jìn)E-cadherin和抑制了N-cadherin的表達(dá),最終通過(guò)抑制EMT效應(yīng)而抑制了HT29細(xì)胞的遷移。

圖3 RAPA誘導(dǎo)的自噬對(duì)HT29細(xì)胞遷移相關(guān)分子表達(dá)的影響Figure 3 Effect of RAPA-induced autophagy on related mRNA and protein levels of HT29 cell migration

2.4 自噬蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果

灰度掃描分析結(jié)果顯示,RAPA處理24 h后的實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著上調(diào),顯著高于對(duì)照組(見(jiàn)圖4),實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,處理組與對(duì)照組差異極顯著。P62/sequestosome 1(SQSTM1)通常與自噬的發(fā)生相反,檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)RAPA處理24 h后,P62降低(見(jiàn)圖4)。這些結(jié)果證實(shí)自噬在HT29細(xì)胞被RAPA激活。

圖4 RAPA處理后LC3和P62蛋白的表達(dá)Figure 4 Expression of LC3 and P62 in HT29 cells after RAPA treatment

3 討論

自噬是細(xì)胞通過(guò)自身的膜結(jié)構(gòu)降解胞質(zhì)細(xì)胞器和大分子,這是在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)觀察到的一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。近來(lái),腫瘤學(xué)家們對(duì)自噬有了新的興趣,因?yàn)椴煌?lèi)型的癌細(xì)胞進(jìn)行各種抗癌療法后都發(fā)生了自噬。自噬在腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)致死亡或保護(hù)細(xì)胞的研究是有爭(zhēng)議的,在多個(gè)研究中[18,19,25],從藥理學(xué)或基因角度抑制自噬,產(chǎn)生了相反的結(jié)果—腫瘤細(xì)胞生存或者死亡,其結(jié)果取決于具體情況。與此同時(shí),有研究報(bào)道,腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生影響其遷移能力,正性或者是負(fù)性的影響也同樣存在爭(zhēng)議[20]。

自噬受到多種信號(hào)通路調(diào)控,其中雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶蛋白(mTOR)是較為重要的一條的信號(hào)通路[21]。mTOR分子與細(xì)胞增殖[16,22]、凋亡等密切相關(guān)。因此我們利用mTOR的特異性抑制劑RAPA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29發(fā)生自噬,通過(guò)免疫熒光觀察到了自噬體的形成,并運(yùn)用Western blotting檢測(cè)到自噬蛋白LC3Ⅱ和P62發(fā)生了相應(yīng)的變化,表明RAPA誘導(dǎo)HT29細(xì)胞發(fā)生了自噬。

自噬能夠影響細(xì)胞的遷移能力。本研究觀察了經(jīng)RAPA誘導(dǎo)自噬后結(jié)腸癌HT29細(xì)胞遷移能力的改變,結(jié)果顯示RAPA誘導(dǎo)的自噬導(dǎo)致HT29細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組及RAPA和CQ聯(lián)合處理組顯著降低,提示HT29細(xì)胞可能通過(guò)自噬抑制了細(xì)胞遷移的能力。由此推測(cè),能夠誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生自噬的藥物能夠抑制該細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

在惡性腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中,E-cadherin的表達(dá)經(jīng)常發(fā)生下調(diào),同時(shí)N-cadherin上調(diào),使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,獲得成纖維細(xì)胞的表型,運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),有利于其發(fā)生轉(zhuǎn)移[23]。本研究利用qPCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)了經(jīng)RAPA處理后HT29細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)變化,結(jié)果顯示E-cadherin的表達(dá)上升,而N-cadherin的表達(dá)下降,表明RAPA誘導(dǎo)的自噬抑制了HT29細(xì)胞的EMT過(guò)程,從而抑制了其遷移的能力。本研究利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了能夠調(diào)節(jié)E-cadherin變化的轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平的變化,結(jié)果顯示Snail-1的表達(dá)量下降,隨后用Western blotting檢測(cè)了其蛋白水平的表達(dá),結(jié)果與之一致,表明RAPA誘導(dǎo)的自噬通過(guò)下調(diào)Snail-1的表達(dá)而減少了Snail-1對(duì)E-cadherin的抑制以及對(duì)N-cadherin的誘導(dǎo)效果,從而減弱了HT29細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述,本研究利用RAPA誘導(dǎo)HT29細(xì)胞發(fā)生自噬后,細(xì)胞遷移能力減弱,表明在結(jié)直癌HT29細(xì)胞中,誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬能夠有效地抑制其發(fā)生轉(zhuǎn)移,為結(jié)腸癌新的有效治療方案提供了理論依據(jù)。