崔雅楠 張傳霞 金浩范

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 1腫瘤中心，吉林 長春 130012；2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院國際細(xì)胞治療中心)

外泌體(exosome)是活的細(xì)胞經(jīng)過一系列“內(nèi)吞-融合-外排”等復(fù)雜的調(diào)控過程形成的有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，直徑30～150 nm，密度1.13～1.21 g/ml，存在于各種體液中，包括血液、尿液、腦脊液及母乳等。剛開始的時候，人們以為外泌體是細(xì)胞排泄廢物的一種方式，外泌體的功能并未受到重視〔1〕。直到2013年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎頒給了三位科學(xué)家，表彰他們在細(xì)胞內(nèi)部囊泡(外泌體等)的運輸調(diào)控機制方面的重大發(fā)現(xiàn)，這引起了更多研究人員對外泌體的興趣，使外泌體的研究達(dá)到了空前的熱度。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，人們漸漸認(rèn)識到外泌體在細(xì)胞間物質(zhì)交換和信息傳遞中的重要作用。近年來，國內(nèi)外針對外泌體與腫瘤關(guān)系的研究主要集中在其促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展和抑制免疫系統(tǒng)兩個方面。癌癥來源的外泌體通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性等多種方式參與腫瘤的診斷與治療。外泌體也涉及腫瘤的免疫逃逸過程，它們可以影響免疫抑制細(xì)胞的分化和激活，調(diào)節(jié)抗原呈遞，并誘導(dǎo)相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞的凋亡。自然殺傷(NK)細(xì)胞作為人體的重要免疫細(xì)胞，其殺傷活性不受主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制，不依賴于抗體，能快速溶解某些腫瘤細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，因此NK細(xì)胞抗癌功能的開發(fā)與應(yīng)用是近年來癌癥研究的重點內(nèi)容。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，腫瘤來源的外泌體(TEXs)具有抑制NK細(xì)胞活性的作用〔2〕，本文將對此做簡要綜述。

1 TEXs的生物學(xué)特性

1.1組成 與大部分細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體一樣，TEXs也是由蛋白質(zhì)、核酸及少部分脂類物質(zhì)構(gòu)成。其中蛋白質(zhì)占據(jù)了很大部分，以參與外泌體本身基本結(jié)構(gòu)構(gòu)成的蛋白質(zhì)和不同腫瘤細(xì)胞來源的特異性蛋白質(zhì)為主，前者常見有多泡小體(MVB)相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)基因-2相互作用蛋白(ALIX)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)及四糖蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等，已被廣泛用作外泌體標(biāo)志物，用以檢測及鑒別外泌體；后者與所覆蓋的具體腫瘤類型有關(guān)，常見的有自殺相關(guān)基因配體(FasL)、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等腫瘤抗原和免疫抑制蛋白。

除蛋白質(zhì)外，TEXs還含有大量的mRNA和miRNA。這些核糖核酸類物質(zhì)可以通過轉(zhuǎn)運作用于靶細(xì)胞影響其基因表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此TEXs攜帶的不同mRNA和miRNA與癌癥的早期診斷及治療密切相關(guān)。例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生的外泌體可以通過調(diào)節(jié)miR-1587作用于靶基因刺激腫瘤細(xì)胞增殖，相關(guān)研究也表明腦脊液中的外泌體含有的特異性RNA可以作為診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的特異性標(biāo)志物，在判斷腫瘤分期及預(yù)后方面發(fā)揮重要作用〔3〕；P53突變的結(jié)腸癌細(xì)胞可以在腫瘤微環(huán)境中選擇性釋放富含miR-1246的外泌體，通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的攝取轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤激活狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移，使TP53突變的結(jié)腸癌患者預(yù)后不佳〔4〕。這些發(fā)揮重要功能的核酸類物質(zhì)，在外泌體中種類較多、含量豐富，與癌癥細(xì)胞的自我調(diào)控息息相關(guān)，現(xiàn)已成為近年來研究的熱點〔5〕。此外，外泌體包含的脂質(zhì)成分主要來源于細(xì)胞的質(zhì)膜，在某些生物學(xué)過程中也起到一定的調(diào)控作用〔6〕。

1.2功能 從已知的研究結(jié)果來看，TEXs由于成分不同、生物學(xué)特性的差異，分別從抑制和激活兩方面對腫瘤起雙重調(diào)控作用。

一方面，TEXs可通過多種途徑誘導(dǎo)有效的抗腫瘤效應(yīng)，激活免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等。如我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝癌來源的外泌體可以將其特異性抗原傳遞給樹突細(xì)胞誘發(fā)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的殺瘤效應(yīng)，為腫瘤的免疫治療提供了新思路〔7〕。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞來源的外泌體可作為天然載體將CRISPR/Cas9質(zhì)粒傳遞給癌癥細(xì)胞，進(jìn)而抑制poly(ADP-核糖)聚合酶1的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡〔8〕。關(guān)于胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體研究較多，早期實驗發(fā)現(xiàn)它可以通過增加細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax的含量、降低抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)多途徑的細(xì)胞凋亡，如(PI3K/Akt)信號傳導(dǎo)通路及Notch-1依賴的細(xì)胞凋亡途徑〔9〕。近年來相關(guān)蛋白組學(xué)試驗表明，胰腺癌來源的外泌體分泌的細(xì)胞膜表面含有大量的網(wǎng)蛋白，在細(xì)胞模型及動物試驗中均證實該類蛋白可以抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移〔10〕。

雖然不斷有研究發(fā)現(xiàn)TEXs具有一定的抗腫瘤潛能，但另一方面，更多的證據(jù)提示TEXs對預(yù)后不佳的晚期腫瘤發(fā)揮了免疫抑制作用，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展，甚至與癌癥細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)。例如：相關(guān)研究表明肝細(xì)胞癌(HCC)來源的外泌體通過傳遞14-3-3ζ蛋白至腫瘤浸潤性T細(xì)胞(TIL)，抑制了TIL活化、增殖及抗瘤效應(yīng)〔11〕；此外，肝癌來源的外泌體通過miR-1247-3p靶向特殊調(diào)控基因，誘導(dǎo)癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞活化，使腫瘤微環(huán)境分泌大量炎癥因子促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔12〕；急性髓細(xì)胞白血病(AML)的外泌體可以下調(diào)骨髓造血干細(xì)胞的功能，這是通過促進(jìn)抑制正常造血因子DKK1的表達(dá)實現(xiàn)的，它幫助建立適合惡性細(xì)胞成長繁衍的骨髓微環(huán)境促進(jìn)白血病的進(jìn)展〔13〕；在化療耐藥方面，乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體通過具有獨特的90 kD形式的血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)激活促進(jìn)腫瘤血管生成，且這種外泌體相關(guān)的VEGF與VEGF的靶向藥物貝伐單抗的結(jié)合能力差，進(jìn)而引起貝伐單抗藥物的耐藥〔14〕。

隨著實驗技術(shù)水平的提高及外泌體提純技術(shù)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明腫瘤的產(chǎn)生、侵襲和遷移與外泌體的關(guān)系十分密切。在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)過程中，外泌體的物質(zhì)交換與信息傳遞功能在癌癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞中發(fā)揮了雙重作用。

2 TEXs對NK細(xì)胞功能的影響

NK細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)距今已有40多年，它是機體固有免疫重要的毒性細(xì)胞，近年來隨著腫瘤精準(zhǔn)治療的提出及免疫治療的興起，NK細(xì)胞因其殺傷活性不受MHC的限制、不依賴抗體的特點而倍受學(xué)者關(guān)注與研究。NK細(xì)胞具有抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)的功能，此外，在某些情況下，NK細(xì)胞與自身免疫性疾病和超敏反應(yīng)的發(fā)生也有一定的關(guān)聯(lián)。作為機體抵御腫瘤和病原體的第一道防線，TEXs對NK細(xì)胞功能的改變及其機制值得深入研究。

NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與免疫清除功能的發(fā)揮由它表達(dá)的各種受體分子和相應(yīng)配體之間的關(guān)系所決定，其活性取決于細(xì)胞表面的活化性受體和抑制性受體之間的平衡〔15〕。NK細(xì)胞的識別和殺傷效應(yīng)機制主要有自身天然的細(xì)胞毒性、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)及NK細(xì)胞通過釋放顆粒酶和穿孔素等細(xì)胞毒顆粒，活化NK細(xì)胞表達(dá)的FasL配體和TRAIL分子誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡等。NK細(xì)胞也可以通過產(chǎn)生除了顆粒酶和穿孔素外的細(xì)胞因子(如IFN、TNF、IL-1、IL-5、IL-8、IL-10等)及NK細(xì)胞受體家族，常見如免疫球蛋白超家族(KIR和KAR)、C型凝集素受體家族(NKG2D)等對NK細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)控。NK細(xì)胞的功能也與其不同亞群(如CD56lim和CD56bright)相關(guān)。

癌癥患者的NK細(xì)胞介導(dǎo)低水平的抗腫瘤活性和低含量的激活受體，如NKp30、NKp46、NKG2C和NKG2D，相關(guān)研究表明該現(xiàn)象與TEXs密切相關(guān)〔16〕。

據(jù)報道，前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體通過下調(diào)NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的受體NKG2D的表達(dá)，抑制免疫細(xì)胞的殺瘤效應(yīng)，誘導(dǎo)免疫逃逸進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和遷移〔17〕。經(jīng)檢測，由AML患者的血清中分離出來的外泌體富含大量的CD33、CD34、CD117和TGF-β1，它們抑制NKG2D受體的表達(dá)和誘導(dǎo)Smad磷酸化，進(jìn)而影響了NK細(xì)胞活性，當(dāng)中和TGF-β1時，這種抑制情況就消失不見了〔18〕。由此我們推測，AML細(xì)胞來源的外泌體相關(guān)的TGF-β1會下調(diào)NK細(xì)胞活性，對NK細(xì)胞功能有抑制作用，甚至對其他血液腫瘤及實體瘤也存在該機制可能。

腫瘤衍生的外泌體可以通過降低機體免疫力，改變腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；相反，免疫細(xì)胞來源的外泌體可以通過增強機體免疫力對抗腫瘤。在一項較新的實驗〔19〕中，研究者將神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤細(xì)胞擴張后在體內(nèi)分離出的NK細(xì)胞來源的外泌體，并在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行體外培養(yǎng)進(jìn)而探索其腫瘤本身的效能。發(fā)現(xiàn)暴露于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的NK細(xì)胞來源的外泌體能夠表達(dá)CD56、NKG2D和KIR2DL2受體，對比正常細(xì)胞來源的NK細(xì)胞分泌的外泌體，前者對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞毒性作用更大。韓國慶北國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究組探討了NK細(xì)胞來源的外泌體在體內(nèi)外對黑素瘤的抗瘤效應(yīng)。該研究發(fā)現(xiàn)，對正常細(xì)胞沒有影響的NK細(xì)胞來源外泌體對黑色素瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。在體外，通過FasL抑制劑可以減輕NK細(xì)胞來源外泌體對黑色素瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，誘導(dǎo)黑色素瘤的凋亡。在體內(nèi)，研究人員通過建立小鼠模型，發(fā)現(xiàn)外泌體處理組的腫瘤顯著小于對照組，證實了NK細(xì)胞外泌體的腫瘤抑制作用，該研究為腫瘤免疫治療提供了新思路〔20〕。

3 結(jié) 語

在TEXs的相關(guān)研究中，既往的研究多數(shù)是探索癌癥細(xì)胞釋放的外泌體對腫瘤本身的影響，但較少了解其對免疫功能尤其是NK細(xì)胞的影響。NK細(xì)胞作為機體免疫的重要屏障，其功能的研究與活性的調(diào)控對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。在細(xì)胞水平上證明TEXs對NK細(xì)胞活性的影響，何種成分，蛋白質(zhì)、核酸還是脂質(zhì)，何種作用機制導(dǎo)致的TEXs對NK細(xì)胞活性的改變更值得進(jìn)一步的研究。可以預(yù)見，隨著外泌體蛋白組學(xué)及基因組學(xué)的發(fā)展、提純技術(shù)的提高，人們對外泌體，乃至整個細(xì)胞囊泡系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的機制及腫瘤細(xì)胞與NK細(xì)胞之間的調(diào)控將進(jìn)一步深入闡述，外泌體的臨床應(yīng)用將具有更廣闊的空間和更良好的前景。