徐天依 寧保安 劉穎

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究所環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所)

目前，大部分臨床檢驗(yàn)都需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的工作人員使用專業(yè)儀器進(jìn)行樣品采集，測(cè)試和分析。配備這些專業(yè)人員費(fèi)用較高，并且檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到由操作者錯(cuò)誤造成系統(tǒng)誤差的影響。這些臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段耗時(shí)，操作復(fù)雜，而且造價(jià)昂貴。因此，急需開發(fā)造價(jià)低廉，反應(yīng)靈敏，快速，便攜式，無需標(biāo)記和易于操作的醫(yī)療檢測(cè)工具。光子晶體(PC)是具有不同介電常數(shù)的周期性排列的材料，特殊的周期性的結(jié)構(gòu)使它們具有很多獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)。當(dāng)PC結(jié)構(gòu)受到外界的刺激而變化時(shí)，其產(chǎn)生的光學(xué)現(xiàn)象也會(huì)隨之改變?；谶@一原理開發(fā)的PC傳感器具有許多超越現(xiàn)有的其他競(jìng)爭(zhēng)型生物傳感技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，比如制造方法簡(jiǎn)單，成本經(jīng)濟(jì)實(shí)惠和測(cè)定時(shí)間短。PC結(jié)構(gòu)現(xiàn)已被用于檢測(cè)多種生物樣品中的生物標(biāo)志物，如血液、尿液、汗液和眼淚等，其應(yīng)用前景不可估量。

1 PC傳感技術(shù)簡(jiǎn)介

PC結(jié)構(gòu)是由介電材料在空間中周期性排列形成，這種特殊的結(jié)構(gòu)會(huì)使電磁波受到入射光在介電邊界處反射的影響而不能傳播，即產(chǎn)生光子帶隙(PBG)，這也是PC材料最主要的光學(xué)特征〔1〕。在應(yīng)用中，PC結(jié)構(gòu)可以在一維(1-D)，二維(2-D)或三維(3-D)方向上制造，包括微腔，波導(dǎo)，平板，多層薄膜及多孔規(guī)則幾何形狀〔2～6〕。一維PC(1D-PC)結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單，其周期性僅存在于一個(gè)維度中，也被稱為布拉格反射器或布拉格反射堆，它們只能特定地反射一種波長(zhǎng)，通常通過逐層沉積，多次旋涂或光刻等技術(shù)來制備〔7〕。二維PC(2D-PC)結(jié)構(gòu)的特征為其在兩個(gè)空間方向上的周期性，主要通過復(fù)雜的自上而下方法制造，例如納米壓印光刻和電化學(xué)蝕刻技術(shù)等〔8〕。盡管2D-PC的溝槽和多孔結(jié)構(gòu)為生物化學(xué)相互作用提供了更高的表面積，但當(dāng)應(yīng)用于臨床樣品時(shí)較大的生物分子(例如細(xì)胞)可能會(huì)在通道內(nèi)聚集，甚至導(dǎo)致阻塞。三維PC(3D-PC)結(jié)構(gòu)在立體三維中具有周期性。常見的3D-PC結(jié)構(gòu)例如蛋白石PC和反蛋白石PC，這種稱謂源于自然界中一類存在三維周期性結(jié)構(gòu)的礦石，其表面十分光滑且具有炫目的虹彩色。制備3D-PC的方法有很多，其中化學(xué)自下而上的方法相對(duì)而言更經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，主要是通過納米級(jí)的單分散微球進(jìn)行自組裝來構(gòu)成PC主體，自組裝法是利用了顆粒間相互作用的特性，例如靜電斥力、磁力、慣性力和毛細(xì)現(xiàn)象等〔9〕。微球取材廣泛，可以選擇二氧化硅、氧化鋅、二氧化鈦或有機(jī)聚合物如聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯等〔10〕。3D-PC陣列是由存在于空氣或溶劑等電介質(zhì)中的電介質(zhì)微球構(gòu)成。將布拉格定律與Snell折射定律相結(jié)合可以發(fā)現(xiàn)，如果反射波長(zhǎng)受化學(xué)或生物相互作用的刺激而改變，會(huì)使PC結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列光學(xué)現(xiàn)象變化，可以應(yīng)用于傳感檢測(cè)〔11〕。微球中心距離和介質(zhì)折射率是兩個(gè)可導(dǎo)致反射波長(zhǎng)變化的變量。兩者經(jīng)常同時(shí)變化，其中改變晶格間距通常更為容易，但利用折射率變化或單個(gè)光子晶體改變的傳感器則具有更高的靈敏度和更快的響應(yīng)時(shí)間，例如在PC中引入水凝膠制作反蛋白石PC〔12〕。PC表面受外部刺激引起有效折射率的變化，從而使共振波長(zhǎng)峰值發(fā)生偏移，其偏移量可用于評(píng)價(jià)生物化學(xué)作用的情況。 目前PC結(jié)構(gòu)在開發(fā)生物化學(xué)傳感器領(lǐng)域已經(jīng)獲得了極大的關(guān)注，已被廣泛應(yīng)用于捕獲，檢測(cè)和量化各種生物分子，如病原體、核酸、蛋白質(zhì)、酶、葡萄糖、細(xì)胞和癌癥生物標(biāo)志物等〔13～19〕。

2 PC傳感技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

2.11D-PC 1D-PC主要由材質(zhì)不同的兩種薄膜交替排列而成，由于其與光發(fā)生鏡面反射，因此制作中不宜選用對(duì)光吸收較強(qiáng)和散射作用較大的材料。Bouzidi等〔20〕提出了一種基于1D-PC結(jié)構(gòu)的生物傳感器，用于監(jiān)測(cè)血糖。該研究將1D-PC中兩種材料的交替層中間的空層注滿血液，血液層導(dǎo)致透射光PBG內(nèi)出現(xiàn)電磁模式，其頻率取決于血液中葡萄糖的濃度，進(jìn)而達(dá)到了檢測(cè)的目的。Sinibaldi等〔21〕報(bào)道了使用一種利用1D-PC與外部均勻介質(zhì)之間的布洛赫表面波，結(jié)合熒光檢測(cè)的光學(xué)平臺(tái)，可對(duì)細(xì)胞裂解液中乳腺癌生物標(biāo)志物ERBB2臨床相關(guān)濃度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.3 ng/ml(1.5 pmol/L)。另外Rizzo等〔22〕利用Bloch表面波特性設(shè)計(jì)了一種新型集成生物傳感平臺(tái)。作者將1D-PC直接沉積在低成本的一次性塑料生物芯片上，使用夾心免疫測(cè)定法檢測(cè)緩沖液、細(xì)胞上清液和人血漿中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，該平臺(tái)在人血漿樣品中檢測(cè)到低至3.5 ng/ml的VEGF，且分辨率高，檢測(cè)速度快(30 min)，并且與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)果非常一致。但1D-PC的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，大部分情況下只作為傳感元件，具體檢測(cè)還需要依賴一些外部設(shè)備，如熒光檢測(cè)等，這也限制了它在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。

2.22D-PC材料 2D-PC的制造方式有很多，其中納米壓印光刻(NIL)是一種快速，簡(jiǎn)單且可擴(kuò)展的圖案轉(zhuǎn)移技術(shù)，可替代需要昂貴設(shè)備和復(fù)雜操作的電子束光刻。在NIL方法中，首先在母模上使用深紫外或電子束光刻生成圖案，然后可以輕松地將其轉(zhuǎn)移到復(fù)制品上。Endo等〔23〕成功通過NIL技術(shù)制造了2D-PC聚合物，并將慢性阻塞性肺病(COPD)的生物標(biāo)志物纖維蛋白原的抗原修飾在其表面，利用抗原-抗體的高靈敏度反應(yīng)，使PC的衍射峰發(fā)生紅移，即可在1 h內(nèi)有效地?zé)o標(biāo)記檢測(cè)纖維蛋白原，檢測(cè)限為100 pg/ml。另有Su等〔24〕根據(jù)涂覆金的2D-PC上局域表面等離子體共振(LSPR)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)載脂蛋白E4基因序列相關(guān)DNA的檢測(cè)。這項(xiàng)研究中，作者使用了NIL方法在柔性共聚物膜上制造2D-PC結(jié)構(gòu)，證明其具有制作應(yīng)用于診斷方面的小型化和可穿戴式生物傳感器的前景。目前NIL方法已被用于快速可靠地批量生產(chǎn)PC結(jié)構(gòu)，然而由于磨損，單個(gè)模具可制備的復(fù)制品數(shù)量有限，模具的使用壽命也較短〔8〕。2D-PC結(jié)構(gòu)也可以與水凝膠結(jié)合制作傳感器，其優(yōu)勢(shì)在于①2D陣列和水凝膠可獨(dú)立制造，2D陣列可以在聚合過程中附著在水凝膠表面上或嵌入水凝膠中;②傳感器的響應(yīng)可以通過測(cè)量德拜環(huán)而不是使用光譜儀來確定;③2D-PC傳感器的讀數(shù)是可靠的，因?yàn)閬碜?D材料的衍射光與折射率無關(guān)。高敏君等〔25〕將分子印跡技術(shù)與2D-PC水凝膠結(jié)合起來，制備了一種特異性檢測(cè)紅霉素的PC傳感器，通過測(cè)量由于單色光垂直射入2D-PC結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的德拜環(huán)的變化，來反映紅霉素的濃度。另有一項(xiàng)研究，Chen等〔26〕提出了一種新型的凝膠化單層膠體晶體PC材料，用于監(jiān)測(cè)淚液中的葡萄糖。研究者將二維組裝的微球膠體包埋在4-硼苯甲醛修飾的聚乙烯醇(PVA)水凝膠中。當(dāng)葡萄糖分子與硼酸鹽結(jié)合時(shí)，PVA和硼酸根離子的比例發(fā)生變化，導(dǎo)致水凝膠體積改變，伴隨著結(jié)構(gòu)色明顯轉(zhuǎn)變。在180 s內(nèi)，葡萄糖濃度從0變化到20 mmol/L，其結(jié)構(gòu)顏色可以從紅色變?yōu)辄S色再變?yōu)榫G色。作者進(jìn)一步檢測(cè)了眼淚中葡萄糖濃度，證明該傳感器具有高精度和高靈敏度特征，這種智能傳感材為進(jìn)一步開發(fā)例如用于葡萄糖點(diǎn)監(jiān)測(cè)的隱形眼鏡等可穿戴醫(yī)療器材提供了一定的可能性。

2.33D-PC 3D-PC可分為孔洞型和非孔洞型材料，孔洞型材料主要指3D有序的多空穴材料，是指向堆壘好的膠體PC中灌入交聯(lián)劑，通過紫外光照射等手段使交聯(lián)劑發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，再通過腐蝕或煅燒手段將膠體顆粒除去，形成具有有序結(jié)構(gòu)的大孔材料。非孔洞型材料是指單分散的膠體顆粒在介質(zhì)中周期性排列形成的PC結(jié)構(gòu)。介質(zhì)為空氣時(shí)形成的結(jié)構(gòu)稱為膠體晶體，介質(zhì)為單體水凝膠交聯(lián)聚合時(shí)形成的結(jié)構(gòu)稱為膠體晶體有序陣列(PCCA)。Wu等〔27〕提出了一種蛋白石PC傳感材料，可以無標(biāo)記檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)。由甲基丙烯酸甲酯和3-丙烯酰胺基苯基硼酸聚合而成的單分散微球，通過垂直沉降自組裝，堆壘成PC，利用TRF與微球上硼酸基團(tuán)的反應(yīng)，制備成對(duì)TRF特異性響應(yīng)的PC傳感器，隨著TRF濃度增加，衍射峰強(qiáng)度降低。TRF的檢測(cè)限為2×10-3～200 ng/ml，并進(jìn)行了模擬尿樣中TRF濃度的測(cè)量，為臨床診斷中的TRF測(cè)定提供了廉價(jià)且易于使用的替代方案。Elsherif等〔28〕將微工程光學(xué)漫射器結(jié)構(gòu)壓印在苯基硼酸官能化水凝膠薄膜中，漫射器使入射光聚焦在不同焦距和方向上，從而在透射和反射模式中讀出漫射的光分布。由于苯硼酸可以可逆地與葡萄糖分子的順式二醇結(jié)合，使水凝膠體積膨脹，改變其陣列原有秩序，進(jìn)而改變水凝膠薄膜的焦距，因此可以測(cè)量通過傳感器的透射光學(xué)光傳播和強(qiáng)度，以確定生理?xiàng)l件下葡萄糖濃度的變化。作者將這種傳感器集成在隱形眼鏡中并放置在人造眼睛上。人工刺激葡萄糖濃度的變化可以使用智能手機(jī)的光電二極管進(jìn)行定量測(cè)量。利用智能手機(jī)app將接收光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為定量葡萄糖濃度值。這種檢測(cè)方案可以設(shè)置在可穿戴實(shí)時(shí)生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)設(shè)備中以供護(hù)理點(diǎn)使用。Lee等〔29〕制備了基于SiO2的反蛋白石PC結(jié)構(gòu)作為生物傳感器。作者使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，琥珀酰亞胺基-N-馬來酰亞胺基丙酰胺基-四乙二醇酯作為交聯(lián)劑制備了反蛋白石PC結(jié)構(gòu)，然后利用蛋白G將抗體固定在其表面來捕獲流感病毒。由于抗體抗原特異性結(jié)合造成有序大孔材料結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致衍射峰的紅移，可以通過監(jiān)測(cè)反射光譜來無標(biāo)記檢測(cè)流感病毒。該材料在噬斑103～105單位(PFU)范圍內(nèi)顯示出高靈敏度，并且對(duì)甲型H1N1流感病毒具有高度特異性。另外3D有序孔洞型材料還可以與記憶材料結(jié)合，通過多空穴的塌陷和復(fù)位來可逆的檢測(cè)氣體中的丙酮〔30〕，由于糖尿病患者呼吸中含有丙酮，該技術(shù)有望應(yīng)用于糖尿病酮癥酸中毒的監(jiān)測(cè)。

3 結(jié) 語

臨床上對(duì)生物分子的檢測(cè)面臨多重挑戰(zhàn)，包括缺乏集中化實(shí)驗(yàn)室，技術(shù)能力有限，缺乏熟練員工及醫(yī)療保健管理系統(tǒng)較差(特別是在資源有限的環(huán)境中)等問題?；赑C的生物傳感器代表了一類先進(jìn)的新型光學(xué)生化傳感器，可以一定程度上解決這些難題。PC材料可以通過簡(jiǎn)單的手段，使用便宜的原料如金屬、氧化物、塑料、聚合物和玻璃等來大量生產(chǎn)。最近，PC結(jié)構(gòu)已經(jīng)與智能手機(jī)，柔性材料和可穿戴傳感器等新興技術(shù)相結(jié)合，這更提高了它作為診斷工具的利用率。但臨床樣品中通常包含細(xì)胞和組織等復(fù)雜的生物流體，這些可能干擾PC傳感器的換能過程，并且一些PC結(jié)構(gòu)目前只做到了定性檢測(cè)，還需研發(fā)更精確的讀出系統(tǒng)。雖然仍有很多難關(guān)尚未攻克，但PC材料應(yīng)用于臨床檢測(cè)的前景不容小覷，這需要我們繼續(xù)努力，開發(fā)出更加方便快捷，經(jīng)濟(jì)實(shí)用的臨床醫(yī)療檢測(cè)設(shè)備。