吳濤 張慧賢 張方州 鄭中兵

摘 要 以人心果果實為研究材料，以水、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯和石油醚共計5種溶劑對人心果果實部位進行提取，對5種提取劑提取的樣液分別進行DPPH自由基清除活性、鐵離子還原能力（FRAP）、ABTS自由基清除活性及總黃酮含量進行測定。結(jié)果表明，使用不同溶劑的人心果提取樣液測定結(jié)果中存有一定的差別，樣液抗氧化活性由高到低的排序為：70%乙醇>乙酸乙酯>甲醇>水>石油醚;此外，研究結(jié)果顯示，人心果的抗氧化活性與總黃酮含量存在較好的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 人心果;提取劑;總黃酮;抗氧化活性

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.27.066

人心果（Manilkara zapota）是山欖科人心果屬[1]，原產(chǎn)地在美洲熱帶，后又引種到印度和東南亞等地，我國人心果是由華僑從東南亞引種而來[2-3]。果樹屬于常綠喬木，具有白色乳汁，因其樹形美姿常用于觀賞領(lǐng)域;果實為漿果，成熟時呈灰褐色或銹褐色，果肉呈現(xiàn)黃褐色透明狀，果皮和果肉不易分離，有核[4-5]。人心果中含有大量的有益物質(zhì)，何鋼等[6]發(fā)現(xiàn)人心果乳汁中具有多種對人體有益的化學成分，可進一步開發(fā)，作為多應(yīng)用領(lǐng)域的植物。李安平等[7]發(fā)現(xiàn)人心果對于·OH、ABTS+、DPPH·的清除作用較好。張秀梅等[8]在人心果葉的研究中發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力較好。馬飛躍等[9]在研究人心果葉片時發(fā)現(xiàn)，葉片中含有較高的抗氧化成分，同時采用多種方法測定人心果葉片抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)結(jié)果存在差別。在實驗室測定水果抗氧化能力時，提取劑的選擇較為單一，類似研究也較為少見。然而想要全面客觀地反映某種水果的抗氧化活性必須設(shè)定在不同的反應(yīng)條件中進行比較[10]，溶解水果成分的提取劑環(huán)境便是一個重要影響因素。

由于近年對人心果果實的研究相對較少，因此本研究選擇營養(yǎng)價值較高的熱帶名優(yōu)水果——人心果。研究選取了甲醇、70%乙醇、水、乙酸乙酯和石油醚這5種較為常見的溶劑對人心果進行提取，并通過DPPH法、FRAP法、ABTS法分析樣液的抗氧化能力。3種抗氧化測定方法在國內(nèi)食品抗氧化能力測定中很常見，且比較方便。此外，研究測定了人心果的總黃酮含量，并分析了其與抗氧化能力之間的相關(guān)性。

1 材料

1.1 實驗材料

人心果購自?？谀媳彼袌?，經(jīng)檢查確定新鮮且無病蟲害。

1.2 試劑

甲醇、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、水溶性維生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）、Folin-Ciocalteu、蘆丁。

1.3 儀器

KF10920單道可調(diào)移液槍、KD12283單道可調(diào)移液槍、AS220.R1萬分之一電子分析天平、粉碎機、T6新世紀紫外可見分光光度計、DHG-9053A干燥箱、HH-4A數(shù)顯恒溫水浴鍋、DW100實驗室超純水機、KQ5200E型超聲波清洗機、TGL-16S臺式高速冷凍離心機。

2 方法

2.1 樣液的提取

2.1.1 樣品的制備

將人心果洗凈后去皮切成片，放置在烘干箱中烘干，溫度為70 ℃，烘干時間約4 d。期間要保證烘干箱保持該狀態(tài)，切忌斷電。4 d后用粉碎機粉碎5 min，若仍存在顆粒大的樣品，可增加時長，或者用研缽將大顆粒研磨成粉末狀，在室溫下用保鮮袋保存。

2.1.2 稱量

使用分析天平稱取3組0.100 0 g樣品，并置于5 mL離心管中，標記序號。

2.1.3 樣液制備

使用無水乙醇配制70%乙醇，用移液槍吸取4 mL，加入離心管并充分振蕩。為了使水果的溶解更加充分徹底，將樣品進行超聲處理。超聲處理結(jié)束后將離心管擦拭干后離心，離心前要對每組進行稱量配平，達到每組盛有樣液的離心管質(zhì)量一致的標準。配平后放入離心機，35 ℃條件下，5 000 r·min-1離心7 min。離心結(jié)束后，小心取出離心管，避免振蕩，將每個離心管上清液取出，按順序置于相應(yīng)的10 mL離心管中。為了使樣品提取更加充分，向已提取上清液的5 mL離心管中加入3 mL70%乙醇，充分振蕩每個離心管后，進行第2次超聲離心，離心后合并兩次上清液并冷藏保存。用等體積蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚代替70%乙醇溶液按照同樣的操作步驟進行樣液制備。

2.2 DPPH自由基清除能力測定

依據(jù)Thaipong等[11]的方法，以Trolox作為標準樣品，做適當改進。取重量為0.062 6 g的Trolox標準品，使用70%乙醇溶液定容至25 mL，配制成濃度為10 mmol·L-1的Trolox乙醇溶液作為該實驗的母液。將母液按照表1進行濃度稀釋并編號。將標準溶液與2 mLDPPH甲醇溶液混合，充分搖勻后置入暗箱中，20 min后于517 nm處測量吸光值，用蒸餾水作對照，得到標準曲線（y=-7 978x+2 738.7，R?=0.975 3）。

取25 μL樣品提取液，按照以上步驟反應(yīng)，于同等條件下測定不同提取液的DPPH自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測定測定物質(zhì)中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.3 FRAP法測定抗氧化能力

按照“2.2”配制Trolox母液并稀釋編號。取1 mL蒸餾水與10 μL標準溶液混合稀釋，搖勻后在體系中加入1.8 mL TPTZ溶液，混勻后在37 ℃反應(yīng)10 min后于593 nm處測量吸光光度值，結(jié)果如表2所示，用蒸餾水作對照，得到標準曲線（y=5 043x-457.59，R?=0.989 7）。

取10 μL樣品提取液，按照以上步驟反應(yīng)，在相同條件下測定3個提取液的鐵離子還原能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測定物質(zhì)中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.4 ABTS自由基清除能力測定

依據(jù)于靖[12]的方法，配制Trolox母液并稀釋編號。取5 mLABTS溶液（7 mmol·L-1）和88 μL K2S2O8水溶液（140 mmol·L-1），避光反應(yīng)12 h后于732 nm處測量吸光光度值，結(jié)果如表3所示，用蒸餾水作對照，得到標準曲線（y=-4 730.9x+3 210.4，R?=0.988 8）。

取25 μL樣品提取液，按照以上步驟反應(yīng)，于同等條件下測定3個提取液的ABTS自由基清除能力（mmol·L-1Trolox·g-1DW），其含義為1 g測定物質(zhì)中等量于Trolox的抗氧化活性。

2.5 總黃酮測定

參照李洪芹[13]的總黃酮提取方法并加以改進，按照下表配制不同濃度蘆丁。取1 mL蘆丁溶液與0.15 mL的5% NaNO2混合，反應(yīng)6 min;反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)加入0.15 mL的10% AlCl3，反應(yīng)6 min;再向體系中加入2 mL 4% NaOH及5 mL蒸餾水，反應(yīng)15 min。在420 nm處測定吸光值，結(jié)果如表4所示，得到標準曲線（y=0.920 3x-0.000 1，R2=0.998 7）。

取1 mL樣液，按照以上步驟反應(yīng)，于同等條件下測定3個提取液中的總黃酮含量，結(jié)果以蘆丁等價值g/100 g-1表示。

2.6 數(shù)據(jù)分析方法

采用IBM SPSS Statistics V21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平為0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 DPPH自由基清除能力

如圖1所示，人心果果實樣提取液具有一定的DPPH自由基清除能力，不同組別存在一定的差異。在清除能力上，乙酸乙酯提取液的抗氧化活性強度高于其余4種，水、石油醚、70%乙醇提取液測得的結(jié)果活性強度一般，甲醇測得的人心果抗氧化活性強度最差。

3.2 還原抗氧化能力（FRAP）

如圖2所示，在人心果的FRAP法測定抗氧化能力測定中，5種提取物均顯示出一定的還原能力，不同組別存在一定差異，提取劑分別為70%乙醇和甲醇的兩組還原抗氧化能力大致相同，明顯高于其他組，而提取劑為石油醚、乙酸乙酯時，還原抗氧化能力最弱。

3.3 ABTS自由基清除能力

圖3為ABTS法測定人心果樣液清除ABTS自由基的結(jié)果。不同組別存在一定差異，選用70%乙醇測得的活性強度最高，其次為水和甲醇，石油醚和乙酸乙酯的活性強度最弱。

3.4 總黃酮含量測定

從圖4可知，在人心果的總黃酮含量測定中，不同組別測定的含量存在一定差別。乙酸乙酯組測定的結(jié)果明顯較高，甲醇及70%乙醇的總黃酮含量一般且基本相同，含量最低的是石油醚和水。

3.5 相關(guān)性分析

通過表5可知，在0.05水平（單側(cè)）上，ABTS自由基清除法與FRAP法測得抗氧化活性強度呈顯著相關(guān)，使用DPPH法測得的活性強度結(jié)果與總黃酮含量相關(guān)。

3.6 Topsis綜合分析

為進一步綜合研究比較各種提取劑對人心果測定結(jié)果的影響，研究對測定的結(jié)果采用了Topsis綜合分析。

從表6中可得知，經(jīng)過綜合分析比較，這5種溶劑中用70%乙醇提取人心果抗氧化活性物質(zhì)效果最佳，其次是乙酸乙酯、甲醇和水，石油醚效果最差。

4 結(jié)論與討論

近年來，抗氧化活性研究在不同溶劑提取某種物質(zhì)的相關(guān)研究中較為常見，牛德芳等[14]對油菜蜂花粉、蜂糧的水和醇提取物研究中發(fā)現(xiàn)，利用醇提取的蜂花粉和蜂糧測定結(jié)果比水好。趙玉紅等[15]用多種溶液對薔薇葉花青素、總黃酮、總酚進行提取并測定抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)60%乙醇提取物的含量較高。田強等[16]對厚樸籽不同溶劑的萃取物進行比較分析，得到的結(jié)論是乙酸乙酯提取效果最好，與本實驗中通過Topsis分析后發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯組的活性較強的結(jié)論類似。如果需要全面、科學地評價研究對象的抗氧化能力，應(yīng)采用更合理科學的抗氧化活性測定方法進行測定，如ORAC法。ORAC法測量總體抗氧化能力，可以客觀地反映出即刻脂質(zhì)過氧化程度[17]。

通過結(jié)果分析可知，提取劑的不同會影響到人心果抗氧化活性的測定結(jié)果，在這5種提取劑中，乙酸乙酯最適合用于DPPH法對人心果的測定，70%乙醇、甲醇適合用于FRAP法對人心果的測定，70%乙醇適合用于ABTS法對人心果的測定。通過綜合分析之后，70%乙醇是較適合人心果的提取劑。此外，從結(jié)果分析中可以知道DPPH法結(jié)果與總黃酮含量在0.05水平（單側(cè)）上相關(guān)，人心果的抗氧化能力與總黃酮含量也存在良好的相關(guān)性。

參考文獻：

[1] 楊威.人心果幾種主要病蟲害及其防治[J].現(xiàn)代園藝，2015（6）：60.

[2] 林更生.閩南的人心果[J].亞熱帶植物科學，1997，72（2）：12-17.

[3] 溫放，梁桂友，Hans.人心果[J].環(huán)球人文地理，2012（1）：157-157.

[4] 周開兵，陳夢暉.人心果栽培學要點總結(jié)及其在海南開發(fā)利用前景分析[J].中國農(nóng)學通報，2006（3）：379-383.

[5] 張麗霞，楊坤，肖春芬.人心果的生物學特性及其栽培技術(shù)[J].中國南方果樹，2001（6）：37.

[6] 何鋼，文亞峰，毛紹名，等.人心果乳汁成分的定性分析[J].經(jīng)濟林研究，2004（2）：38-41.

[7] 李安平，謝碧霞，王森，等.人心果、星蘋果和曼密蘋果抗氧化活性比較[J].園藝學報，2008（2）：175-180.

[8] 張秀梅，駱黨委，朱祝英，等.3種熱帶果樹葉子甲醇粗提物的抗氧化活性比較[J].核農(nóng)學報，2015，29（1）：95-100.

[9] 馬飛躍，張秀梅，劉玉革，等.人心果葉片提取物抗氧化活性評價[J].中國南方果樹，2016，45（6）：79-82.

[10] 翁新楚，吳侯.抗氧化劑的抗氧化活性的測定方法及其評價[J].中國油脂，2000（6）：119-122.

[11] THAIPONG K，BOONPRAKOB U，CROSBY K，et al.Comparison of ABTS， DPPH， FRAP， and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts[J].Journal of Food Composition and Analyis，2006，19（6/7）：669-675.

[12] 于靖.杜仲種質(zhì)資源及其果實質(zhì)量評價[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2015.

[13] 李洪芹.白花鬼針草總黃酮提取工藝研究[J].山東化工，2017，46（13）：30-32.

[14] 牛德芳，王波，張靜，等.油菜蜂花粉及其蜂糧不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2019，40（6）：42-46.

[15] 趙玉紅，師帥帥，張立鋼.‘魯赫刺薔薇葉不同溶劑提取物的活性成分及抗氧化性比較[J].現(xiàn)代食品科技，2019，35（5）：159-166.

[16] 田強，趙琳，羅毅沖，等.厚樸籽不同溶劑萃取物抗氧化活性比較分析[J].食品工業(yè)科技，2019，40（18）：54-58，64.

[17] 嚴歡，韓飛，李慕春.ORAC法對薰衣草非精油組分的抗氧化活性研究[J].食品科技，2018，43（12）：277-280.

（責任編輯：趙中正）