吳嬈，竇心敬，張良曉，馬飛，王秀嬪，丁小霞，張奇，李培武,5

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢 430062)(2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，湖北武漢 430062)(3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，湖北武漢 430062)(4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，湖北武漢 430062)(5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物毒素檢測重點實驗室，湖北武漢 430062)

我國是食用油生產(chǎn)和消費(fèi)大國，食用油在居民膳食中占據(jù)著重要地位，食用油的質(zhì)量安全問題一直以來都是政府和消費(fèi)者高度關(guān)注的熱點問題。在食用油加工、流通和使用過程中，餐飲業(yè)產(chǎn)生的餐廚廢棄油脂（地溝油、潲水油）、煎炸老油等劣質(zhì)油，氧化酸敗程度較高，含有許多有害物質(zhì)如黃曲霉毒素、重金屬、表面活性劑、苯并芘、丙烯酰胺、熱氧化聚合產(chǎn)物等[1,2]，若食用會嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者身體健康。這些劣質(zhì)油作為廢棄油脂，可以用于發(fā)展生物柴油、制造肥皂、表面活性劑等[3～6]加以回收利用，不能回收精煉重新投入食用油市場。然而在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，餐廚廢棄油脂非法回收并經(jīng)過一系列加工和精煉回流至餐桌的現(xiàn)象屢禁不止，并成為了不法商販牟取高額利潤的手段。為了保護(hù)消費(fèi)者身體健康，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，探索和發(fā)展廢棄油脂摻偽鑒別方法尤為重要。

目前廢棄油脂鑒別方法的相關(guān)報道也很多，主要分為以下四類。一是基于常規(guī)理化指標(biāo)如酸價、過氧化值、電導(dǎo)率等的方法[2]，然而廢棄油脂在經(jīng)過嚴(yán)格的精煉和深加工處理后，通常會在出廠前滿足以上這些常規(guī)理化指標(biāo)，因而該類方法已逐漸不能滿足精煉廢棄油脂的鑒別。二是基于紅外、離子遷移譜、核磁共振等全譜宏觀信號并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)鑒別模型對廢棄油脂進(jìn)行識別[7～10]，該類方法建立模型時通常需要較大樣本量，判別時基于概率，可能出現(xiàn)誤判的情況。三是基于廢棄油脂外源引入的特征成分進(jìn)行鑒別分析，廢棄油脂來源復(fù)雜，在回收利用過程中外源引入的潛在殘留成分如膽固醇、辣椒素、十二烷基苯磺酸鈉、黃曲霉毒素、重金屬、氯離子、鈉離子、乙酸根離子、香辛料揮發(fā)性成分茴香腦等[2,11～13]可以作為廢棄油脂的鑒別指標(biāo)。四是基于油脂在高溫反復(fù)利用過程中內(nèi)源性成分發(fā)生的變化，如反式脂肪酸、甘油三酯熱氧化聚合產(chǎn)物等[14,15]指標(biāo)。但是廢棄油脂在經(jīng)過高度精煉后，許多特征性成分可能會被除去，因而不具有代表性。

餐廚廢棄油脂（地溝油）來源復(fù)雜，在回收利用時通常需要集中混合后再加以精煉處理，決定了其混合油脂的屬性。大豆油因其價格優(yōu)勢，占據(jù)了大量市場份額，備受餐館經(jīng)營者的青睞，是餐飲行業(yè)中應(yīng)用最普遍的食用油。廉價的大豆油可以降低經(jīng)營成本，帶來更高的利潤，因此在混合的餐廚廢棄油脂中幾乎全部含有大豆油的痕跡。本研究旨在探究大豆油中標(biāo)志物的熱穩(wěn)定性以及大豆異黃酮在食用植物油和餐廚廢棄油脂中的分布，探究異黃酮類標(biāo)志物在餐廚廢棄油脂摻偽鑒別中的應(yīng)用，為地溝油等廢棄油脂檢測和市場監(jiān)管提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆，購買于中百超市（湖北武漢），利用全自動家用榨油機(jī)進(jìn)行榨油。收集得到的大豆毛油，在4500 r/min下離心5 min，取上清油液備用。采集芝麻、油菜、茶籽、花生和亞麻籽，采用實驗室自榨方式分別得到 100%純芝麻油、菜籽油、茶籽油、花生油和亞麻籽油，所選食用植物油樣品具有廣泛的代表性。餐廚廢棄油脂，收集來自不同地方的餐廚廢棄油脂 15個，經(jīng)過簡單的吸附脫色處理。

摻偽油樣：分別向茶籽油、菜籽油、花生油、芝麻油和亞麻籽油中摻入 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）餐廚廢棄油脂，制備摻偽油樣。

制備的油樣均置于4 ℃條件下避光儲藏，以供實驗分析用。

1.2 主要儀器設(shè)備

全自動家用榨油機(jī)，液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(TSQ Quantum Ultra)，美國Thermo公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)；KQ-600B超聲儀；BF-2000型氮氣吹干儀；DB-3電熱板；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；電子天平等

1.3 試劑

甲醇、正己烷、甲酸均為色譜純；醋酸、FeCl3·6H2O、石油醚、乙二醇、無水乙醇、乙酸鈉均為分析純；羧基化多壁碳納米管購買于南京先豐納米材料科技有限公司(長度約30 μm，直徑＜8 nm，羧基含量：3.86%)；異黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品黃豆苷（Daidzin，純度≥98%）、染料木苷（Genistin，純度≥97%）、黃豆苷元（Daidzein，純度≥95%）、染料木素（Genistein，純度≥97%）均購買于sigma。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品黃豆苷、黃豆苷元、染料木素和染料木苷各 10.0 mg，分別用甲醇進(jìn)行溶解，定容至10.0 mL，即得1.0 mg/mL單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，轉(zhuǎn)移至專用棕色瓶內(nèi)，-20 ℃避光保存；分別移取0.1 mL單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液混合，用甲醇定容至10.0 mL，制備10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)貯液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，封口膜封好保存于4 ℃冰箱，使用時用甲醇稀釋成不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.2 磁性羧基化多壁碳納米管復(fù)合材料（c-MWCNT-MNPs）的制備

參考已報道的方法[16]并稍做調(diào)整合成復(fù)合材料c-MWCNT-MNPs。稱取0.2 mg的羧基化多壁碳納米管粉末于50 mL內(nèi)含磁攪拌子燒杯中，加入1.8 g乙酸鈉和0.7 g FeCl3·H2O，再量取40 mL乙二醇倒入其中，進(jìn)行磁力攪拌，攪拌30 min，將溶液裝入100 mL聚四氟乙烯內(nèi)膽高溫反應(yīng)釜中，200 ℃下反應(yīng)12 h。待充分反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將內(nèi)膽中的上清液棄丟，其殘留黑色沉淀物用水來回超聲清洗5次，之后再用無水乙醇來回超聲洗滌5次，用玻璃瓶收集沉淀物，在 60 ℃水浴下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行干燥，去溶劑，得到黑色粉末物質(zhì)即復(fù)合材料磁性羧基化多壁碳納米管，實驗備用。

1.4.3 樣品提取

準(zhǔn)確稱取0.5 g待測油樣于10 mL玻璃試管內(nèi)，加入4.0 mL正己烷稀釋，混勻，再加入5 mg磁性羧基化多壁碳納米管復(fù)合材料，渦旋提取 2 min，磁吸倒液；加入1 mL石油醚進(jìn)行雜質(zhì)淋洗，磁吸倒液；用3 mL 0.02%（V/V）甲酸無水乙醇溶液洗脫，超聲6 min，磁吸，上清液過0.22 μm有機(jī)膜，收集液體，氮吹濃縮，用200 μL 1：1流動相溶液復(fù)溶，供LC-MS/MS分析。

1.4.4 液相色譜質(zhì)譜分析

液相色譜條件：色譜柱為Hypersil Gold C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），流動相A 0.01%（V/V）醋酸-甲醇溶液，流動相B 0.01%（V/V）醋酸-水溶液，流速是 200 μL/min，進(jìn)樣量 10 μL，柱溫30 ℃，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Elution program for liquid chromatography

質(zhì)譜條件：離子源選用ESI源，選擇正離子模式掃描，噴霧電壓為4000 V，毛細(xì)管溫度為270 ℃，檢測方式為SRM（選擇離子掃描）模式，鞘氣為30 psi（氮氣），輔助氣為5 arb（氮氣），碰撞氣為1.5 mTorr（氬氣），掃描時間為0.2 s，化合物離子對信息如表2所示。

表2 異黃酮類化合物的質(zhì)譜參數(shù)條件Table 2 LC-MS/MS parameters for isoflavonoid compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及評估

本實驗采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，每一種化合物選擇其最強(qiáng)特征離子（m/z）的峰面積與對應(yīng)濃度擬合回歸方程。定量數(shù)據(jù)處理軟件利用 Xcalibur軟件(Version 2.0.7；Thermo Fisher Scientific，USA)，以每種化合物的系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制對應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程，通過標(biāo)準(zhǔn)方程計算得出提取液濃度，最后根據(jù)單位換算從而得到植物油中含量。根據(jù)信噪比（S/N）3倍和10倍分別確定各個化合物的檢出限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantitation，LOQ），線性方程及相關(guān)系數(shù)、靈敏度等參數(shù)如表3所示。

表2 異黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及靈敏度Table 3 Standard curve, equations coefficients (R2) and sensitivity of isoflavonoid compounds

2.2 大豆油中異黃酮類物質(zhì)的熱穩(wěn)定性研究

圖1 加熱時間對大豆異黃酮含量的影響Fig.1 Effects of heating time on isoflavone contents

前期制備的大豆油樣，分裝部分于100 mL燒杯中，放在電熱板上于160 ℃加熱，模擬反復(fù)加熱過程，分別經(jīng)過0、2、6、10和14 h加熱，在不同時間點各取出其中一部分油樣進(jìn)行編號，后續(xù)實驗備用。

分別從不同時間段中準(zhǔn)確稱取0.5 g大豆油樣于10 mL試管中進(jìn)行異黃酮類物質(zhì)的提取分析，其操作步驟見樣品提取部分，待測樣品經(jīng)LC-MS/MS分析，探究大豆油中異黃酮類物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。異黃酮物質(zhì)的含量變化如圖1所示。

從圖1可以看出，在前2 h內(nèi)，加熱對異黃酮含量影響最大，四種化合物含量明顯下降，而在之后的加熱過程中，尤其是8～14 h之間，異黃酮類物質(zhì)含量趨向平穩(wěn)，表明異黃酮類物質(zhì)對熱相對穩(wěn)定，在反復(fù)精煉過程中可能不易除盡；結(jié)果表明，黃豆苷和染料木苷在加熱的過程中明顯的降低，可能與糖苷鍵斷裂有關(guān)。雖然黃豆苷元和染料木素的含量相對有所降低，但其含量比之前測定的其他自榨食用植物油中黃豆苷元和染料木素含量高出很多，其他食用植物油不含有黃豆苷元和染料木素或者不同時含有。因此，黃豆苷元和染料木素可以作為餐廚廢棄油脂摻偽鑒別新的標(biāo)志物，為鑒別餐廚廢棄油脂摻偽提供可靠的依據(jù)。

2.3 餐廚廢棄油脂中異黃酮類物質(zhì)定量分析

表4 餐廚廢棄油脂中大豆異黃酮類含量Table 4 Contents of isoflavonoids in waste oils（μg/kg）

利用c-MWNT-MNPs-LC-MS/MS方法對15個餐廚廢棄油脂中大豆異黃酮類物質(zhì)進(jìn)行定量分析，每個樣品測定三次，結(jié)果取平均值，并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到餐廚廢棄油脂中大豆異黃酮類含量分布情況，見表4。

從表4中結(jié)果可知，餐廚廢棄油脂中黃豆苷元平均含量在 5.4～221.5 μg/kg之間，染料木素介于10.2～230.5 μg/kg之間，黃豆苷和染料木苷含量非常低，有些甚至檢測不到，這可能是由于在加熱過程中，黃豆苷和染料木苷中糖苷鍵遭到破壞，與大豆油中異黃酮類物質(zhì)熱穩(wěn)定性研究結(jié)果一致。進(jìn)一步比較大豆油和廢棄油脂中異黃酮類種類和含量，大豆油中同時含有四種大豆異黃酮，而廢棄油脂中的黃豆苷元和染料木素含量高，以及染料木苷少量，且都不含有黃豆苷。利用種類和含量關(guān)系的差異，通過檢測黃豆苷和染料木苷即可將大豆油和廢棄油脂加以區(qū)分。其他食用植物油不含有或者不同時含有大豆異黃酮類化合物，因此黃豆苷元和染料木素可以作為識別餐廚廢棄油脂與其他食用植物油新的標(biāo)志物，為建立鑒別餐廚廢棄油脂摻偽技術(shù)提供參考依據(jù)。

2.4 聚類分析

為了更直觀的反映餐廚廢棄油脂與食用植物油聚類效果以及異黃酮類化合物的分布，本文對廢棄油脂異黃酮類含量與其他食用植物油含量數(shù)據(jù)在代謝組學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析平臺MetaboAnalyst 3.0中進(jìn)行HCA分析，得到圖2所示的熱圖。

圖2 餐廚廢棄油脂與其他食用食用植物油的系統(tǒng)聚類分析熱圖Fig.2 Heatmap for restaurant waste oil and edible plant oils

在圖2中，可以清晰明了的看到異黃酮類物質(zhì)在餐廚廢棄油脂以及其他食用植物油中的分布。大豆油中含有豐富的異黃酮類成分，并且黃豆苷元顏色最深，代表含量最高，其次是染料木素，然后是黃豆苷和染料木苷；而廢棄油脂中黃豆苷元和染料木素含量高，因此以黃豆苷和染料木苷標(biāo)志物即可將大豆油和餐廚廢棄油脂區(qū)別開來。在圖2中1號紅色與2號綠色沒有重疊部分，表示完全分開；對比其他食用植物油與餐廚廢棄油脂，其他食用植物油中幾乎不含有或者含有微量的黃豆苷元或染料木素，指紋圖譜相近；而餐廚廢棄油脂相反，在圖中其他顏色所代表的食用植物油與1號紅色沒有交叉，這表明餐廚廢棄油脂能夠完全與其他食用植物油分開，所以可以將黃豆苷元和染料木素作為餐廚廢棄油脂新的標(biāo)志物，用于識別食用植物油中餐廚廢棄油脂摻偽現(xiàn)象。

2.5 標(biāo)志物在實際摻偽樣品鑒別中的應(yīng)用

從異黃酮類化合物在廢棄油脂中分布及聚類分析得出的結(jié)論，以黃豆苷元和染料木素為廢棄油脂標(biāo)記物，建立餐廚廢棄油脂摻偽鑒別方法。選取茶籽油、花生油、葵花籽油、亞麻籽油和芝麻油作為摻偽對象，將餐廚廢棄油脂分別摻入正常食用食物油中，其摻偽量為5%，油樣經(jīng)過前處理，供LC-MS/MS分析，每個樣品測定三次，定量分析結(jié)果見表5。

由表5可知，在菜籽油、花生油、茶籽油、亞麻籽油及芝麻油當(dāng)中摻入 5%餐廚廢棄油脂，都能檢出餐廚廢棄油脂的標(biāo)志物，即黃豆苷元和染料木素，確證性地鑒別餐廚廢棄油脂的摻偽行為，為打擊廢棄油脂摻偽現(xiàn)象提供一種檢測手段。

在色譜圖上可以更加直觀地呈現(xiàn)出來，如圖3所示，是當(dāng)芝麻油中摻入 5%餐廚廢棄油脂時異黃酮類化合物的譜圖。圖3（a）是純芝麻油樣中異黃酮類化合物的色譜圖，（b）是摻入 5%餐廚廢棄油脂的芝麻油中異黃酮類化合物色譜圖。從圖3中可以看出，在純芝麻油樣中沒有檢測到異黃酮；當(dāng)摻偽 5%餐廚廢棄油脂后，就能明顯的看到黃豆苷元和染料木素的峰，而黃豆苷和染料木苷未檢測到，這就直觀上說明不是純芝麻油，并且能肯定是摻偽了餐廚廢棄油脂而非大豆油。由此看出，以異黃酮類物質(zhì)作為餐廚廢棄油脂的標(biāo)志物，可以有效鑒別餐廚廢棄油脂摻偽，是一種靈敏度高、確證性檢測技術(shù)。

表5 摻偽5%餐廚廢棄油脂的各食用植物油中大豆異黃酮類含量Table 5 Contents of isoflavonoids in vegetable oils adulterated with 5% waste oil

圖3 芝麻油(a)和摻偽餐廚廢棄油脂的芝麻油(b)色譜圖Fig.3 Chromatograms of sesame oil and sesame oil blended with waste oil

3 結(jié)論

本文通過對廢棄油脂來源及流通進(jìn)行分析，以大豆油異黃酮類標(biāo)志物為切入點，探究了異黃酮類標(biāo)志物的熱穩(wěn)定性以及大豆異黃酮在食用植物油和餐廚廢棄油脂中的分布。篩選到餐廚廢棄油脂新的標(biāo)志物：黃豆苷元、染料木素；在反復(fù)加熱模擬實驗中，標(biāo)志物經(jīng)過14 h持續(xù)加熱仍然存在，且含量比其他食用植物油高得多，結(jié)果表明標(biāo)記物具有熱穩(wěn)定性，加工過程中不易除盡；同時，測定了標(biāo)志物在餐廚廢棄油脂及植物油中的分布，聚類分析表明異黃酮類物質(zhì)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)其他食用植物油中大豆油或餐廚廢棄油脂的摻偽鑒別，亦可區(qū)分大豆油和餐廚廢棄油脂。異黃酮類物質(zhì)是廢棄油脂中一種有效可靠的標(biāo)志物，本文探究考察了以異黃酮類物質(zhì)為標(biāo)志物的餐廚廢棄油脂摻偽鑒別方法，該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為地溝油等廢棄油脂檢測和市場監(jiān)管提供參考依據(jù)。