史生鴻，李旭軍，張威，姜靜，段百蕓，錢飚，莊志剛

作者單位： 315010寧波，寧波市第二醫(yī)院（史生鴻、李旭軍、張威、姜靜、段百蕓、錢飚）；上海市第一婦嬰保健院（莊志剛）

乳腺癌作為女性常見的惡性腫瘤，呈現(xiàn)逐年上升和年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1-2]。目前，乳腺癌的治療已取得顯著進(jìn)展，然而對(duì)于惡性腫瘤患者來說最重要的致命原因?yàn)槟[瘤的轉(zhuǎn)移，如能提前發(fā)現(xiàn)腫瘤是否轉(zhuǎn)移并找出判斷轉(zhuǎn)移的腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)乳腺癌的防治具有十分重要的意義[3]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，橋粒相關(guān)蛋白（PNN）是參與細(xì)胞連接的相關(guān)基因[4]。其不僅能促使上皮細(xì)胞緊密粘連，抑制細(xì)胞從靜止向運(yùn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化；而且參與調(diào)節(jié)mRNA前體的選擇性剪接和轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA到細(xì)胞核中[5-6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PNN基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[7-10]。本研究探討PNN的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為研究乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的參考資料，為探索乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及臨床病理資料 收集2015－2017年間寧波市第二醫(yī)院乳腺癌根治術(shù)后石蠟包埋組織 80例及新鮮乳腺癌、癌旁組織80對(duì)。80例石蠟標(biāo)本均為女性，年齡32～71歲，平均（51.5±2.4）歲；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期43例，Ⅲ期+IV期37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例；非浸潤性癌11例，浸潤性癌69例。80對(duì)新鮮乳腺癌、癌旁組織標(biāo)本保存于－80℃冰箱內(nèi)，癌旁組織分別取自標(biāo)本上切緣或下切緣。所有石蠟標(biāo)本都經(jīng)病理檢查證實(shí)，臨床資料完整，并均統(tǒng)一重新切片，HE染色確定病理診斷及進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療或內(nèi)分泌治療等任何抗腫瘤治療。

1.2 方法 凍存的80對(duì)新鮮乳腺癌及癌旁組織取出后研磨成勻漿狀，各置入1.5 ml離心管中，TRIzol（美國Invitrogen，貨號(hào)140501，規(guī)格100 ml）法抽提總RNA。取抽提的總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo，貨號(hào)00422714，規(guī)格 100rxns）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA，－20℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒提供的條件進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果的數(shù)據(jù)，通過公式2－△△Ct計(jì)算PNNmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。RT-qPCR總反應(yīng)體積為10l，包括：SYBRGreen PCRMasterMix（美國羅氏，貨號(hào)22682700，規(guī)格5ml）5l，正向引物0.5l，反向引物0.5l，逆轉(zhuǎn)錄出的DNA模板4.5l，其余用dd H2O補(bǔ)齊。引物序列：PNN基因（由深圳華大基因設(shè)計(jì)合成）正向引物：5’-GGTCTACAAAGGGAAGC-3’，反向引物： 5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’；內(nèi)參GAPDH（由深圳華大基因設(shè)計(jì)合成）正向引物：5’-AAGCCTGCCGGTGACTAAC-3’，反向引物：5’-GCATCACCCGGAGGAGAAAT-3’。

80例女性乳腺癌石蠟標(biāo)本進(jìn)行PNN蛋白表達(dá)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色S-P試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)SNM504，規(guī)格160張片）進(jìn)行。組織切片常規(guī)脫蠟至水，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，放入EDTA抗原修復(fù)液，PBS沖洗，兔血清封閉，滴加兔抗人PNN多克隆抗體（美國Thermo，貨號(hào) PA5-63689，1∶1000），4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗，滴加二抗（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)BA1054，1∶2000），PBS沖洗，滴加DAB顯色劑，復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，封片，顯微鏡觀察，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。PNN陽性信號(hào)呈棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞核。參照Hadi等[11]的免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)，半定量判斷結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件包進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNN在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá) 80對(duì)乳腺癌組織與癌旁組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PNN在乳腺癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。PNN在乳腺癌中的高表達(dá)率為67.5%（54/80）。見封二彩圖1。

2.2 PNN表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示 PNN在乳腺癌不同臨床分期中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PNN的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、腫瘤大小、臨床分級(jí)及病理分型等無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。乳腺癌細(xì)胞中PNN的陽性表達(dá)在鏡下主要出現(xiàn)在細(xì)胞核中，為棕褐色顆粒。Ⅲ期+IV期PNN的陽性表達(dá)率顯著性高于Ⅰ+Ⅱ期，見封二彩圖2。

史生鴻，李旭軍，張威，等.PNN在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系（見正文第1566頁）

圖2 PNN在不同分期乳腺癌組織中的陽性表達(dá)（DAB染色，×10）

3 討論

乳腺癌是一類生物特征各異的疾病，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是由多基因、多階段作用的結(jié)果[12]。傳統(tǒng)的乳腺癌治療方案普遍存在復(fù)發(fā)難治現(xiàn)象、晚期患者生存率低、三陰性、化療或內(nèi)分泌耐藥等問題[13]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子指標(biāo)的靶向治療成了目前的研究熱點(diǎn)之一。

PNN能穩(wěn)定中間纖絲與細(xì)胞橋粒的結(jié)合狀態(tài)，并增強(qiáng)上皮細(xì)胞的黏附性，減少細(xì)胞形態(tài)的變化，防止發(fā)生上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。在上皮細(xì)胞黏附的建立和維持中起著不可或缺的作用[14-15]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，PNN與腫瘤也密切相關(guān)。繼Hodgkinson等[16]2012年首次提到PNN的高表達(dá)可能與化療耐藥的乳腺癌相關(guān)后，其他國內(nèi)外學(xué)者也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)PNN在移行細(xì)胞癌[7]、腎細(xì)胞癌[7]、卵巢癌[8]、結(jié)直腸癌[9]和肝癌[10]等腫瘤中扮演著抑癌或癌基因的角色，并通過不同的調(diào)控機(jī)制，參與細(xì)胞的生物學(xué)功能；且PNN的表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。然而PNN在乳腺癌中的研究甚少。

表1 PNN的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

本研究結(jié)果顯示新鮮乳腺癌組織中的 PNN表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05）；80例乳腺癌石蠟標(biāo)本中，PNN在乳腺癌不同臨床分期中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PNN的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性（P＜0.05）。這說明PNN表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征，生物學(xué)行為有密切關(guān)系，是反映乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)記物之一[17]。

癌基因的激活或抑癌基因的突變是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子學(xué)基礎(chǔ)。檢測(cè)PNN在乳腺癌中表達(dá)，可提高對(duì)乳腺癌惡性表型判斷的準(zhǔn)確性，有助于深入了解腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并可為鑒別診斷、判斷預(yù)后和基因治療提供依據(jù)。人們對(duì)PNN在腫瘤中的研究剛起步，尤其是其蛋白的表達(dá)和調(diào)控研究尚不多，機(jī)制尚在探索階段。因此，拓展研究參與調(diào)控PNN表達(dá)的機(jī)制，將為以PNN為靶點(diǎn)的腫瘤靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。