魯楊，王金秋，郭宇，張樂鳴

作者單位： 315211寧波，寧波大學醫(yī)學院（魯楊、王金秋）；寧波市第一醫(yī)院（郭宇、張樂鳴）

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的惡性腫瘤，占全球惡性腫瘤死亡原因的第3位[1]。CRC的發(fā)展是一個多步驟、多因素過程，而對于其發(fā)病機制目前尚未有一個明確的結(jié)果[2]。微小RNA（miRNAs）是一類長度為22～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中[3]。研究證明miRNA在細胞的增殖、凋亡及侵襲等生物學活動中都發(fā)揮了重要的作用，是腫瘤潛在的治療靶點和預(yù)后預(yù)測指標[4]。miR-455-5p位于第6條染色體上，它在間變性大細胞淋巴瘤[5]、食管癌[6]及胃癌[7]等呈現(xiàn)低表達。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)miR-455-5p在結(jié)腸癌細胞中通過作用于靶基因 galectin-9起著癌基因的作用。但由于該研究入組的組織標本只包含結(jié)腸癌組織，缺乏組織學方面的驗證，并且只在一株結(jié)腸癌細胞株進行研究，不夠全面，也并未全面探討miR-455-5p在CRC中的作用。本研究擬探討miR-455-5p在CRC的表達及其生物學特性，報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本

1.1.1 組織標本 收集2016年3―7月寧波市第一醫(yī)院收治的行手術(shù)治療的CRC患者的組織標本40例，分別切取CRC組織標本與其癌旁正常黏膜組織（≥10 cm），其中結(jié)腸癌標本19例，直腸癌標本21例。40例患者中男24例，女16例；年齡43～85歲，≥60歲28例，＜60歲12例，平均（65±11）歲；采用TNM分期法，Ⅰ期6例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例；病理分化程度為低分化7例，中低分化5例，中分化28例。所有患者術(shù)前未行放、化療或免疫治療，無其他腫瘤病史，術(shù)后病理檢查均由2名病理醫(yī)師診斷。組織標本離體后立刻放入RNA保存液中，于―80℃冰箱中保存。所有過程告知患者并與患者簽署知情同意，此研究經(jīng)寧波市第一醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞株 人結(jié)腸癌 SW-480、HCT-116及HT-29細胞株，均購買于上海諾百公司。

1.2 主要試劑 攜帶有miR-455-5p-mimics的重組質(zhì)粒和 miR-455-5p-inhibitor的重組質(zhì)粒及對照miR-455-5p-mimicscontrol和miR-455-5p-inhibitorcontrol由上海吉瑪公司合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實時熒光定量PCR試劑盒購自南京金斯瑞生物科技公司。轉(zhuǎn)染所需Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑購自上海翊圣生物科技有限公司，PBS購自美國Invitrogen公司；Rnase Inhibitor購自上海拜力生物科技有限公司。培養(yǎng)基DMEM購自中國Thermo公司。AnnexinⅤ-PE/7-AAD凋亡試劑盒購自凱基生物公司。鼠抗人 Brdu單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。山羊抗小鼠IgG熒光二抗購自美國美國AAT Bioquest公司。劃痕試驗所需Protein Marker（DM111-01）購自北京全式金生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 組織標本RNA提取 將組織標本在液氮中研磨，采用Trizol法提取組織總RNA，紫外線分光光度計 NanoDrop ND-1000（NanoDrop，Wilmington，DE）用于評估RNA的濃度和純度。所有RNA樣品置于―80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CRC細胞轉(zhuǎn)染 選擇細胞狀態(tài)良好的3株CRC細胞株進行培養(yǎng)。采用Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染3株細胞株，選取1、2和2l的NegativecontrolFAM轉(zhuǎn)染3株細胞，分別用PBS清洗，加入胰蛋白酶清洗消化，離心，棄上清液，再重復(fù)上述過程2次，觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 miR-455-5p的定量分析 按照試劑盒說明書對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。收集的細胞沉淀進行反轉(zhuǎn)錄到cDNA后，用sybr染料法進行相對定量檢測 miR-455-5p基因的表達水平。檢測miRNA表達量的引物序列見表1。

1.3.4 Brdu增殖檢測 將轉(zhuǎn)染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5P-mimics、mimics-NC 及 inhibitor-NC 48h后的SW480、HT-29、HTC-116細胞株收集細胞制成細胞懸液并計數(shù)。在24孔板中添加培養(yǎng)基并加入生長細胞的蓋玻片，將制備好的細胞懸液分別以2×104接種到24孔板中。加Brdu孵育，濃度10mol/L，時間1h。用PBS清洗3次，加入1%BSA/PBS稀釋Brdu抗體，37℃，2 h或者4℃過夜。用PBS洗5min，重復(fù)3次。再次加入1%BSA/PBS稀釋熒光二抗，37℃下避光孵育45 min。用PBS洗5min，重復(fù) 3次。用DAPI或 hoechst染核（1：10000稀釋），室溫避光10 min。用PBS洗5 min，重復(fù)2次。熒光顯微鏡觀察熒光比例。

1.3.5 凋亡檢測 將轉(zhuǎn)染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5P-mimics、mimics-NC 及 nhibitor-NC 48 h后的CRC細胞接種至細菌培養(yǎng)板中，培養(yǎng)條件改為2%FBS的完全培養(yǎng)基，過夜處理第2天，將細胞重懸于100l Binding Buffer中，加入5l 7-AAD染液。輕輕混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15min；再加入400lBindingBuffer、1lAnnexinV-PE混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，最后在1 h內(nèi)用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測。AnnexinV-PE熒光信號呈橙紅色；激發(fā)波長546nm，發(fā)射波長647nm，觀察7-AAD熒光信號呈紅色，并統(tǒng)計檢測結(jié)果。

1.3.6 劃痕實驗 將轉(zhuǎn)染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5P-mimics、mimics-NC及inhibitor-NC48h后的HT-29細胞收集后制成細胞懸液并計數(shù)備用。用marker筆在12孔板背后，均勻得劃橫線。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0、6、12及24h取樣，拍照。使用ipwin32軟件進行面積和長度的分析計算寬度值。通過細胞間距比例進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

表1 檢測miRNA表達量的引物序列

2.1 miR-455-5p在組織中的表達情況及臨床病理因素分析 用QPCR方法檢測40對配對CRC組織中的miR-455-5p的表達，miR-455-5p在CRC癌組織中相對表達量為（0.59±0.34），在相對應(yīng)的癌旁組織中相對表達量為（2.45±1.60），差異具有統(tǒng)計學意義（t=3.46，P＜ 0.01）。

miR-455-5p的表達量與患者的性別、年齡、腫瘤部位，有無淋巴轉(zhuǎn)移、病理類型、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目無明顯關(guān)系（均P＞0.05），與腫瘤的分化程度有關(guān)（P＜0.05），見表2。

2.2 Brdu檢測miR-455-5p對細胞增殖的影響 將未轉(zhuǎn)染的細胞作為空白對照組，轉(zhuǎn)染 miR-455-5p mimics的細胞作為陽性組，轉(zhuǎn)染miR-455-5p-inhibitor的細胞作為陰性對照組。轉(zhuǎn)染miR-455-5p-inhibitor后3株CRC細胞（HT-29、HCT-116、SW-480）的增殖百分比分別為40%、60%和53%；而過表達miR-455-5p-mimics后的 CRC細胞增殖率受到抑制，其中 HT-29、HCT-116及 SW-480 3株細胞的增殖百分比分別為20%、23%和21%，3株細胞的增殖活性均減弱。陽性組與空白對照組及陰性對照組增殖率變化趨勢差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果 FCM（A-F）顯示轉(zhuǎn)染了 miR-455-5p-mimics的 CRC細胞株（HT-29、HCT-116）的凋亡率分別為 41.43%和48.3%，較miR-455-5p-mimics control組細胞凋亡率（34.82%和39.3%）明顯增加（均P＜0.05）；而在SW-480細胞株中，轉(zhuǎn)染miR-455-5p-5p-mimics凋亡率為11.3%，較轉(zhuǎn)染miR-455-5p-mimicscontrol組的凋亡率（11.81%）無明顯變化。見封二彩圖3。

魯楊，王金秋，郭宇，等.miR-45-5p在結(jié)直腸癌的表達及其生物學特性（見正文第1572頁）

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果

2.4 劃痕實驗檢測miR-455-5p對HT-29細胞遷移能力的影響 對HT-29細胞劃痕處理后，間隔6 h連續(xù)觀察細胞的遷移運動，轉(zhuǎn)染miR-455-5pinhibitor組劃痕24h，細胞已基本完全覆蓋劃痕區(qū)域。見封二彩圖4。

圖4 劃痕實驗檢測：miR-455-5p抑制HT-29細胞株遷移

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達。由于它們在腫瘤中起著癌基因或抑癌基因的作用[9]，如今已經(jīng)成為了腫瘤研究的熱點。隨著miRNA在腫瘤研究方面的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)miRNA與某些抗腫瘤藥物療效密切相關(guān)，并參與腫瘤對藥物敏感性的調(diào)控，這也預(yù)示其在臨床上具有指導作用。研究證實，miRNA在腫瘤早期診斷方面具有獨特的優(yōu)勢[10]。miR-21作為首個在人體體液中發(fā)現(xiàn)的miRNA，Toiyama等[11]通過對比分析186例腸癌組織、43例高級別腺瘤及53例對照組發(fā)現(xiàn)，血清miR-21表達水平隨臨床分期呈階梯狀升高，且其靈敏度及特異度都很高，認為其可作為CRC的篩查手段。該研究還發(fā)現(xiàn)miR-21表達水平可作為影響CRC患者生存的獨立預(yù)后因素。Slaby等[12]發(fā)現(xiàn)，在CRC組織中miR-145表達水平明顯下調(diào)，且其表達水平與腫瘤體積和TNM分期有臨床相關(guān)性，認為miR-145作為抑癌因子在腸癌發(fā)展過程中起到重要作用，尤其在腺瘤惡變?yōu)橄侔┻^程中尤為顯著。miRNA與CRC的相互關(guān)系，為CRC的預(yù)防、診斷和治療提供了新的思路。

miR-455-5p作為miR-455家族中的一員，研究已證明其在腫瘤中起著重要作用。Shoshan等[13]在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn) miR-455-5p負調(diào)控腫瘤抑制因子CPEB1基因，從而促進腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。Hudson等[14]證明miR-455-5p在甲狀腺髓樣癌呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，其在甲狀腺髓樣癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在其他腫瘤，如彌漫性大B細胞淋巴瘤[15]、胸腺上皮腫瘤[16]中也進一步證明miR-455-5p起著抑癌基因的作用，在腫瘤的發(fā)生過程中起著重要的生物學作用。

表2 CRC患者的臨床病理因素

miRNAs表達的改變可以導致遺傳信息表達的改變，從而導致相應(yīng)的病理生理狀態(tài)，而處于一定病理生理狀態(tài)的組織常伴有特定的miRNAs表達[17]。在本研究中，筆者首先證明了miR-455-5p在CRC患者癌組織中表達顯著低于癌旁組織；通過miR-455-5p與CRC患者臨床病理因素進行分析發(fā)現(xiàn)，miR-455-5p的表達量與腫瘤的分化程度有關(guān)。這一結(jié)果也證明了 miR-455-5p可能起著抑癌基因的作用，參與CRC的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究通過轉(zhuǎn)染CRC細胞，通過Brdu檢測、流式細胞儀檢測、劃痕實驗等發(fā)現(xiàn)miR-455-5p可影響CRC細胞的生長，其與腫瘤細胞增殖活性有關(guān)，也與腫瘤細胞凋亡活性的增強密切相關(guān)，由此證實miR-455-5p在CRC中可以作為一個抑癌基因來發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和促凋亡的作用。而本研究的結(jié)果也與miR-455-5p在其他腫瘤的研究一致[13-16]。

目前miR-455-5p在CRC的研究中機制尚不清楚，Yang等[8]在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-455-5p的相對表達較癌旁組織是升高的，并且進一步在HT-29細胞株中發(fā)現(xiàn)其抑制細胞的凋亡，促進細胞的增殖，起著一個癌基因的作用，而這一結(jié)果與本研究的結(jié)果存在差異。筆者認為，兩個研究在實驗設(shè)計方法及研究目的上存在不同，Yang等[8]的研究是采用CCK方法進行增殖實驗，且研究miR-455-5p與galectin-9之間的關(guān)系；而本研究是采用Brdu方法進行檢測，另外該研究在組織樣本量的檢測中只有10例，且均為結(jié)腸癌組織，較本研究數(shù)量上存在差距，并且本研究入組的標本組織種包含了結(jié)腸癌組織和直腸癌組織；在細胞實驗中Yang等[8]的研究也只是在一種細胞株中進行實驗，結(jié)果可能存在偏倚，所以兩個研究結(jié)果出現(xiàn)了差異。本研究與Yang等[8]的研究結(jié)果的差異，也提示miR-455-5p在CRC中可能存在異質(zhì)性，并不像其在其他腫瘤中只表現(xiàn)抑癌作用，可能起著癌基因和抑癌基因的作用，對于以后通過miR-455-5p治療CRC，其治療方式可能不同于其他腫瘤。因此對于miR-455-5p在CRC中的研究還將繼續(xù)。

綜上所述，miR-455-5p在CRC組織中低表達，具有類似抑癌基因的作用，降低了CRC細胞的增殖、遷移能力，為CRC的治療提供了一個新的靶點，但是miR-455-5p是如何在CRC細胞中發(fā)揮作用，以及與其所針對的下游靶基因所介導的通路尚不明確，同時考慮到本研究中所搜集的標本量較少，在樣本數(shù)據(jù)與臨床病理分析中得到的結(jié)論可能缺乏一定的科學性。