周嬋萍，張 普，周伶俐，李向陽

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

流行病學(xué)研究證實，宮頸癌的發(fā)病率可達(273～478)/10萬人[1]。臨床上宮頸癌的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊邿o瘤生存時間的下降，增加了患者的3年內(nèi)的病死風(fēng)險[2]。在探討宮頸癌的發(fā)病機制的過程中可以發(fā)現(xiàn)不同生物蛋白水平的波動，能夠通過影響癌細胞周期的調(diào)控或者癌細胞的基因突變，促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。抑癌基因P16(P16INK4A)的表達，能夠通過提高G1/S期的細胞比例，進而促進宮頸柱狀上皮細胞的增生和異常分化過程[3]；轉(zhuǎn)移抑制基因(KISS-1)能夠通過影響到癌細胞的變形能力，降低癌細胞的黏附和浸潤的風(fēng)險，進而影響惡性腫瘤患者臨床病情的進展[4]。部分研究者探討了P16INK4A或者KISS-1的表達與甲狀腺癌或者直腸癌的關(guān)系，認為相關(guān)腫瘤指標的異常表達能夠顯著促進患者生存預(yù)后的惡化，并導(dǎo)致患者癌細胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險的上升[4-6]，但在宮頸癌患者中的研究探討不足。為了揭示P16INK4A、KISS-1的表達與宮頸癌的關(guān)系，從而為臨床上宮頸癌患者的病情評估提供參考，本次研究選取2017年1月至2018年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院保存的宮頸鱗癌組織102例，探討P16INK4A、KISS-1蛋白的表達及其與宮頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月至2018年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院保存的宮頸鱗癌組織102例，患者年齡34～57歲，平均年齡45.20歲；同時選取正常宮頸組織60例作為對照，年齡31～59歲，平均年齡44.80歲。納入標準：①均經(jīng)病理組織學(xué)確診；②宮頸癌術(shù)前未行放化療等治療；③患者知情同意。排除標準：①合并有其他惡性腫瘤者；②臨床資料欠缺者。

1.2實驗方法

病理標本采用石蠟進行連續(xù)性切片，脫蠟脫水后采用H2O2室溫下孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，8%的蛋白粉封閉液(商品名：BSA，購自南京博奧生物科技公司)封閉2h，倒去封閉液后加入一抗[兔來源，濃度為1：(1 000～1 500)]，4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入二抗[鼠來源，1：(400～500)]，室溫孵育20～30min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標記物，室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，滴加顯色劑(DAB，購自南京博奧生物科技公司)，復(fù)染，脫水，封片。

1.3結(jié)果判斷

P16INK4A定位于細胞核或胞質(zhì)，KISS-1定位于細胞質(zhì)，染色陽性呈棕黃色顆粒。隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，對染色強度和陽性細胞比例進行評分。染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。染色強度和陽性細胞比例得分之和≥3分為陽性表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件，計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，P16INK4A與KISS-1表達的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組織P16INK4A、KISS-1陽性表達率比較

宮頸鱗癌組織P16INK4A陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，KISS-1陽性表達率明顯低于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1、圖1。

表1各組織P16INK4A、KISS-1陽性表達率比較[n(%)]

Table 1 Comparison of positive expression rates of P16INK4Aand KISS-1 between different tissues[n(%)]

組織例數(shù)(n)P16INK4A陽性表達KISS-1陽性表達正常宮頸組織60051(85.00)宮頸鱗癌10293(91.18)27(26.47)χ2128.44058.079P0.0000.000

A B C

注：A為正常宮頸組織KISS-1表達；B為宮頸鱗癌組織KISS-1表達；C為宮頸磷癌組織P16INK4A表達。

圖1部分組織免疫組化圖(×200)

Fig. 1 Immunohistochemical staining (×200)

2.2 P16INK4A及KISS-1表達與宮頸鱗癌臨床病理關(guān)系

分化程度為中低分化的患者P16INK4A陽性表達率明顯高于高分化者(P<0.05)；TNM分期Ⅰ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者KISS-1陽性表達率明顯高于TNM分期Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(均P<0.05)，見表2。

表2 P16INK4A、KISS-1表達與宮頸鱗癌臨床病理關(guān)系[n(%)]

2.3相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示P16INK4A與KISS-1表達呈負相關(guān)(rs=-0.518，P<0.05)，見表3。

表3 P16INK4A與KISS-1表達的相關(guān)性分析

Table 3 Correlation analysis of P16INK4Aand KISS-1

P16INK4A表達 KISS-1表達 陽性陰性rsP陽性1875-0.5180.002陰性90

3討論

3.1 P16INK4A、KISS-1在宮頸癌患者中的相關(guān)背景研究

多次妊娠史或者宮腔操作史均能夠促進宮頸癌的發(fā)生，特別是在合并有HPV16、HPV18感染的患者中，宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險更高，遠期的臨床轉(zhuǎn)歸惡化更為明顯[7-10]。P16INK4A是蛋白激酶家族成員，主要表達在多向分化潛能的細胞或者部分正常的上皮細胞中，在惡性腫瘤或者慢性自身免疫性疾病患者中，P16INK4A的表達濃度可顯著上升。P16INK4A能夠通過對糖蛋白末端的磷酸化修飾作用，導(dǎo)致癌細胞內(nèi)的G1/S期比例的異常，提高癌細胞快速跨越G0期的能力，促進癌細胞的持續(xù)性DNA分裂。P16INK4A的上升能夠?qū)е掳┘毎じ胶娃D(zhuǎn)移能力的上升，增加了腫瘤細胞的擴散風(fēng)險[11]；KISS-1是轉(zhuǎn)移調(diào)控因子，其能夠抑制癌細胞的偽足形成，降低上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換的能力，降低癌細胞浸潤和突破基底膜組織的能力。有研究認為，KISS-1的表達還能夠降低癌細胞金屬基質(zhì)成分分解的速度，降低癌細胞的擴散風(fēng)險[12-13]。

3.2 P16INK4A、KISS-1在宮頸癌患者中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

本次研究通過免疫組化研究了宮頸癌患者病灶組織中相關(guān)蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者病灶組織中，P16INK4A蛋白的表達陽性率明顯上升，而KISS-1蛋白表達陽性率則明顯下降，提示了相關(guān)蛋白的異常表達均能夠促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。筆者認為這主要由于P16INK4A或者KISS-1的下列幾個方面的作用有關(guān)：①P16INK4A的表達上升，能夠?qū)е聦m頸柱狀上皮細胞轉(zhuǎn)錄激活程度的上升，提高了宮頸柱狀上皮細胞的核異常裂變的風(fēng)險；②KISS-1表達濃度的下降，導(dǎo)致癌細胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險的顯著上升，增加了癌細胞對于臨近的宮旁組織的浸潤過程[14]。徐雯等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌患者病灶組織中，P16INK4A的表達陽性率可平均上升25%以上，特別是在合并有明顯的宮旁組織浸潤或者遠處轉(zhuǎn)移的患者中，P16INK4A蛋白的表達陽性率上升更為明顯。免疫組化染色分析研究可見，P16INK4A或者KISS-1蛋白主要表達于癌細胞異型性較為明顯的區(qū)域，提示了二者的表達可能還影響到癌細胞的形態(tài)學(xué)特征。在探討P16INK4A或者KISS-1的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系過程中，可以發(fā)現(xiàn)在癌細胞分化程度較差的患者中，P16INK4A蛋白的表達陽性率可顯著上升，而在臨床分期較晚或者發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，KISS-1蛋白的表達陽性率則顯著下降，提示了P16INK4A或者KISS-1的表達與宮頸癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)，這主要是由于P16INK4A或者KISS-1的表達異常，能夠通過影響癌細胞的黏附浸潤過程，導(dǎo)致癌細胞分化成熟能力和淋巴結(jié)黏附能力的改變，進而促進宮頸癌患者病情進展。相關(guān)關(guān)系分析顯示，P16INK4A與KISS-1蛋白具有負性相關(guān)關(guān)系，推測其可能的內(nèi)在機制主要由于P16INK4A與KISS-1能夠通過影響癌細胞內(nèi)核因子Kappa B(nuclear factor Kappa B, NF-KB)信號通路的激活，進而促進宮頸柱狀上皮細胞增殖速度的加快，增加了癌細胞的浸潤和侵襲的風(fēng)險。

3.3小結(jié)

綜上所述，宮頸癌患者P16INK4A蛋白的表達明顯上升，而KISS-1的表達明顯下降，P16INK4A或者KISS-1的表達與宮頸癌患者臨床病理特征密切相關(guān)，同時二者的表達具有一定的內(nèi)在相關(guān)關(guān)系。