宋 潔，張曉松，畢 蕙

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100034；2.保定市第一中心醫(yī)院婦科，河北 保定 071000)

臨床上對于子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)2級患者的管理一直存在爭議，大量的研究證據(jù)表明CIN1為HPV一過性感染所致的病理改變，約90%婦女病變可自然消退或處于靜止?fàn)顟B(tài)，為非子宮頸浸潤癌的癌前病變，CIN3為子宮頸浸潤癌的癌前病變，如果不干預(yù)，每年有1%～2%的婦女進展為浸潤癌，是目前子宮頸癌早診早治的主要目標(biāo)人群。而CIN2有超過60%的婦女可自然消退或處于靜止?fàn)顟B(tài)，尤其是年輕女性，進展為浸潤癌的幾率低于5%[1-3]。但同時對所有的CIN2患者進行干預(yù)，尤其是年輕婦女可導(dǎo)致恐懼、焦慮等情緒以及妊娠時早產(chǎn)、胎膜早破、低出生體重兒等的風(fēng)險增加[4]。如何平衡干預(yù)的利益與風(fēng)險，如何將組織學(xué)CIN2中真正的高級別病變分流出來并進行針對性的治療是子宮頸癌預(yù)防的關(guān)鍵所在。由于既往的HE染色病理為形態(tài)學(xué)的診斷，人為因素較多，臨床需要一種更為量化的指標(biāo)來輔助病理診斷，以提高病理診斷的準(zhǔn)確性。目前研究也發(fā)現(xiàn)P16INK4A表達(dá)與鱗狀上皮病變的級別高度相關(guān)[5]，2012年美國病理醫(yī)師協(xié)會，陰道鏡檢查與子宮頸病理協(xié)會也建議采用P16INK4A免疫組織化學(xué)染色進一步分流HE染色病理診斷為CIN2的患者，以提高CIN2診斷的特異性。為了進一步闡明P16INK4A免疫組織化學(xué)染色在CIN2患者分流中的作用，本研究將2010年1月至2012年12月及2014年9月至2015年4月在北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科根據(jù)HE染色診斷的CIN2患者進行P16INK4A免疫組織化學(xué)染色分層，并與既往組織學(xué)診斷的CIN2患者進行比較，分析P16INK4A在降低CIN2診斷級別及預(yù)測錐切術(shù)后高級別子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)的作用。

1資料與方法

1.1研究對象

收集北京大學(xué)第一醫(yī)院婦科門診2010年1月至2012年12月及2014年9月至2015年4月在陰道鏡指引下行宮頸多點活檢診斷CIN2患者共444例，年齡在20～76歲，平均年齡(40.34±9.53)歲。所有病例均因子宮頸癌篩查細(xì)胞學(xué)和(或)人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)高危型分型檢測異常轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，并對陰道鏡異常發(fā)現(xiàn)者進行陰道鏡多點活檢組織病理學(xué)檢查，對HE染色形態(tài)學(xué)診斷為CIN2患者行子宮頸錐切術(shù)。

1.2分組情況

444例病理診斷CIN2患者按診斷的時期分為兩組，將2014年9月至2015年4月診斷的107例CIN2患者設(shè)為A組，對HE染色形態(tài)學(xué)診斷CIN2的組織蠟塊再次連續(xù)切片，行P16INK4A免疫組織化學(xué)染色，全部采用P16INK4A分流。根據(jù)P16INK4A染色程度的不同又分為染色陽性組、灶陽組及染色陰性組；并將CIN2 P16INK4A染色陽性者定義為HSIL，將CIN2 P16INK4A染色陰性或灶狀陽性者定義為低級別子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)。同時將2010年1月至2012年12月(該時期尚未開展P16INK4A免疫組化染色)診斷的337例患者設(shè)為B組，CIN的診斷根據(jù)HE染色的形態(tài)學(xué)結(jié)果得出。

1.3陰道鏡檢查指征

細(xì)胞學(xué)未見異常但HPV高危亞型16、18、31、33陽性、細(xì)胞學(xué)不能明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells of undertermined significance，ASC-US)HPV高危亞型陽性、細(xì)胞學(xué)LSIL及以上，以及所有腺上皮細(xì)胞異常者轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，在陰道鏡指引下在病變最異常處行多點活檢，對于不滿意陰道鏡檢查必要時行子宮頸四象限隨機活檢+子宮頸管黏膜搔刮術(shù)(endocervical curettage,ECC)。

1.4子宮頸錐切術(shù)方法選擇

對于陰道鏡指引下多點活檢病理診斷CIN2患者444例全部行子宮頸環(huán)電切術(shù)(Loop electrosurgical excision procedure,LEEP)。所有病理切片均經(jīng)兩位病理科醫(yī)生閱片，對于診斷不一致的病理片由第三位病理醫(yī)生復(fù)審。

1.5 P16INK4A蛋白的檢測及免疫組化陽性結(jié)果判斷

采用免疫組織化學(xué)方法檢測，取子宮頸組織石蠟切片，按試劑盒說明書進行操作，一抗用鼠抗人的P16INK4A單克隆抗體(克隆號E6H4，Roche)，1∶100稀釋。陰性對照為磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗，陽性對照為已知陽性的胰腺切片。免疫組化陽性結(jié)果判定：P16INK4A陽性表達(dá)定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為染色陽性細(xì)胞。著色按陽性細(xì)胞所占百分比并參考著色強度確定分級如下：染色陽性組，上皮彌漫全層染色；灶陽組，局灶、不連續(xù)染色陽性；陰性組，無明顯染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，各年齡組間差異以及不同組間錐切術(shù)后病理級別的差異采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CIN2患者年齡分布

CIN2患者年齡20～76歲，平均年齡(40.34±9.53)歲。其中A組平均年齡(41.80±10.53)歲，B組平均年齡(39.88±9.15)歲，兩組患者在不同年齡段所占比例比較無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=3.698，P=0.055)，見表1。

年齡(歲)A組(n=107)B組(n=337)<255(4.7)7(2.1)25～3425(23.4)103(30.6)35～4443(40.2)134(39.8)45～5421(19.6)68(20.2)55～648(7.5)23(6.8)≥655(4.7)2(0.6)平均年齡41.80±10.5339.88±9.15

2.2 CIN2患者的HPV高危亞型檢測結(jié)果

444例CIN2患者中HR-HPV檢測陰性者18例，占4.1%(18/444)，陽性者426例，占95.9%(426/444)。排在前五位的亞型分別為：HPV16型，占49.1%(218/444)；HPV58型，占15.3%(68/444)；HPV33型，占14.9%(66/444)；HPV18型52型，占13.9%(62/444)；HPV31型，占6.8%(30/444)(對多重型感染者，亞型陽性率重復(fù)計算)。在A組中，HR-HPV陽性者101例，占94.4%(101/107)；在B組中，HR-HPV陽性者315例，占93.5%(315/337)。

2.3 CIN2患者子宮頸錐切術(shù)后病理結(jié)果

A組中，錐切術(shù)后病理≤CIN1共34例，占31.8%(34/107)；CIN2 44例,占41.1%(44/107)；CIN3 29例,占27.1%(29/107)；浸潤癌0例。

B組中，錐切術(shù)后病理≤CIN1共133例,占39.5%(133/337)；CIN2 143例,占42.4%(143/337)；CIN3 60例,占17.8%(60/337)；宮頸癌1例,占0.3%(1/337)。

2.4 A組中P16INK4A染色的表達(dá)

在107例CIN2患者中，P16INK4A陽性者85例，占79.4%(85/107),P16INK4A灶陽者16例，占15.0%(16/107),P16INK4A陰性者6例，占5.6%(6/107)。

2.5子宮頸錐切術(shù)前及術(shù)后病理一致性的比較

陰道鏡下多點活檢病理診斷的444例CIN2患者，錐切術(shù)后病理CIN2及以上的共277例，病理診斷陽性率為62.4%(277/444)，子宮頸活檢病理診斷的CIN2預(yù)測錐切術(shù)后病理診斷為CIN2+的陽性預(yù)測值(positive predictive valve，PPV)為62.4%。A組、B組錐切術(shù)后病理診斷CIN2及以上的陽性預(yù)測值見表2。兩組患者錐切術(shù)前、術(shù)后病理結(jié)果相比無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=5.739，P>0.05)。

表2 A、B組錐切術(shù)后病理診斷CIN2及以上病變的陽性預(yù)測值比較[n(%)]

Table 2 Comparison of PPV of CIN 2 and above in pathological diagnosis after LEEP between group A and group B[n(%)]

2.6 A組中不同P16INK4A的表達(dá)與錐切術(shù)前后病理一致性的比較

按P16INK4A染色程度不同進行進一步分層分析，P16INK4A陽性組與P16INK4A灶陽組及陰性組相比較，錐切術(shù)前后病理一致性的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為10.603、10.733，均P<0.05，調(diào)整α’=0.0167>P值)；灶陽組與P16INK4A陰性組相比較，錐切術(shù)前后病理一致性的差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.873，P=0.350)。

如果采用下生殖道鱗狀細(xì)胞診斷術(shù)語(lower anogenital squemous terminology，LAST)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，A組中有22例P16INK4A陰性者歸為LSIL，占20.6%(22/107)；另85例P16INK4A陽性者歸為HSIL，占79.4%(85/107)，則A組子宮頸活檢病理診斷的HSIL預(yù)測錐切術(shù)后病理診斷為CIN2+的陽性預(yù)測值提高至77.6%。

2.7 B組與A組中不同P16INK4A結(jié)果的比較

B組與A組中P16INK4A陽性組相比較，錐切術(shù)前后病理一致性的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.626，P=0.003)；B組與P16INK4A灶陽組相比較，錐切術(shù)前后病理一致性的差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.818，P=0.098)；B組與P16INK4A陰性組相比較，錐切術(shù)前后病理一致性的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.143，P=0.001)，見表3。

表3 B組與A組中不同P16INK4A結(jié)果下錐切術(shù)后病理結(jié)果的比較[n(%)]

注：aP16INK4A陽性組與灶陽組比較；b灶陽組與陰性組比較；c陰性組與陽性組比較；dB組與A組P16INK4A陽性者的比較；eB組與 A組P16INK4A灶陽者的比較；fB組(組織學(xué)CIN2)與A組P16INK4A陰性者的比較。

3討論

3.1 P16INK4A免疫組織化學(xué)染色可對HE病理診斷的CIN2分流，提高HSIL診斷的一致性

目前的研究發(fā)現(xiàn)P16INK4A蛋白可與cyclinD1競爭性結(jié)合CDK4，抑制CDK4 酶活性，P16INK4A/CDK-cyclinD/Rb分子復(fù)合物是細(xì)胞出G1期進入S期的關(guān)鍵因子，該分子鏈中任何基因異常都可使該分子失去細(xì)胞周期的控制作用。高危型HPV表達(dá)的E7蛋白通過與PRb結(jié)合擾亂了Rb基因的正常功能，使其功能失活，解除了PRb對P16INK4A蛋白表達(dá)的負(fù)反饋抑制，引起P16INK4A過表達(dá)[6]，導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，使其具有永生性的特點而啟動一系列癌變過程[7-10]。李思琦等[11]曾對35歲以下CIN患者的病理切片行P16INK4A及Ki67免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)二者染色的陽性率與CIN的分級有著非常好的一致性。

既往的研究發(fā)現(xiàn)不同病理學(xué)家對于HE染色診斷的CIN2的可重復(fù)性差，一致性低于50%[12]。2007年在美國癌癥協(xié)會督導(dǎo)項目中Castle等兩位病理專家回顧CIN2病理片的診斷一致性僅有13%及31%，而CIN3的診斷一致性可達(dá)84%及81%。2009年在美國ALTS研究中Dalla 等發(fā)現(xiàn)CIN2的可重復(fù)性僅有43%。Meta分析發(fā)現(xiàn)與單純HE染色相比，輔助使用p16INK4A染色提高了診斷者間的診斷一致性[13]。2012年美國病理醫(yī)師協(xié)會和陰道鏡檢查與子宮頸病理協(xié)會建議采用肛門下生殖道HPV相關(guān)的鱗狀上皮病變術(shù)語，將既往的子宮頸上皮內(nèi)瘤變病理診斷分級分類法改為二級分類，即LSIL與HSIL，并建議采用P16INK4A免疫組織化學(xué)染色對HE病理診斷的CIN2進行進一步分流，將CIN1及CIN2 P16INK4A陰性者歸為LSIL,將CIN2 P16INK4A陽性及CIN3歸為HSIL，2014年WHO出版的第4版《女性生殖器官腫瘤分類》關(guān)于子宮頸鱗狀上皮癌前期病變也建議采用了鱗狀上皮內(nèi)病變兩級命名即LSIL與HSIL。

3.2 P16INK4A免疫組織化學(xué)染色分流CIN2可降低20.6%患者的診斷級別，提高預(yù)測錐切術(shù)后CIN2+的能力

本研究通過對不同時期CIN2錐切術(shù)前后病理級別的對比發(fā)現(xiàn)陰道鏡下多點活檢病理診斷CIN2的對于錐切術(shù)后病理CIN2+總的陽性預(yù)測值為62.4%，但經(jīng)過P16INK4A染色，僅對染色陽性的HSIL患者進行治療時，可降低20.6%患者的診斷級別，同時也減少了對20.6% CIN2患者的有創(chuàng)干預(yù)，并可將子宮頸活檢病理診斷的HSIL錐切術(shù)后診斷CIN2+的陽性預(yù)測值提高至77.6%。Maniar等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)采用P16INK4A免疫組化染色分流子宮頸活檢病理診斷的CIN2患者時，可減少1/3 HSIL的診斷，同時發(fā)現(xiàn)用于手術(shù)前預(yù)測病變的級別更準(zhǔn)確，可避免不必要的有創(chuàng)干預(yù)。Clinton等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)由于廣泛使用P16INK4A免疫組化染色，子宮頸活檢病理的HSIL 診斷自1.4%提高至2.3%(P<0.05)，同時P16INK4A陽性的HSIL的陽性預(yù)測值由48%增加至76%(P<0.05)。

在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)A組中P16INK4A染色陽性者錐切術(shù)前后的病理一致性明顯高于P16INK4A染色灶狀陽性及陰性婦女，分別為77.6%、37.5%及16.7%，并均有統(tǒng)計學(xué)差異，這一結(jié)果也支持了美國LAST項目對于CIN患者進行P16INK4A分流并進行分層管理的理念。但在研究中也發(fā)現(xiàn)有15.0%(16/107)的患者P16INK4A染色上皮區(qū)域呈現(xiàn)灶狀、不連續(xù)染色陽性，這部分患者按照美國LAST項目中的管理是與P16INK4A染色陰性者一并歸為P16INK4A陰性，屬于低級別病變范疇，建議臨床隨訪觀察。但在我們的研究中也看到對于P16INK4A灶狀陽性及陰性的CIN2患者進行錐切后也分別診斷了6例(6/16，37.5%)及1例(1/6)的CIN2，由于納入的病例僅為107例，標(biāo)本量相對較小，目前尚未見到術(shù)后為CIN3的病理，但也應(yīng)引起足夠的重視。尤其是對于P16INK4A染色灶狀陽性患者，這部分患者的臨床結(jié)局與P16INK4A陰性者是否完全一致，在隨訪過程中進展為HSIL的比例是否高于P16INK4A陰性婦女仍需要擴大樣本量，并進行進一步的前瞻性研究。但在目前尚無足夠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的情況下建議密切隨訪，以免漏診。

總之，對待CIN2患者的管理應(yīng)個性化，尤其是在年輕有生育要求婦女中，建議行P16INK4A染色進一步分流，對于染色陽性者可行子宮頸消融或切除性治療，對于P16INK4A灶狀陽性或陰性婦女建議結(jié)合患者年齡、既往篩查歷史、細(xì)胞學(xué)及HPV檢測結(jié)果、陰道鏡滿意度等進行綜合評估，避免治療的過度與不足。