郭 悅，姜平平，潘雷雷，周文杰，徐 磊，張茹琴，隋炯明， 郭寶太，王晶珊，喬利仙

(1.青島農業(yè)大學 生命科學學院，山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島農業(yè)大學 農學院， 山東省旱作農業(yè)技術重點實驗室，山東 青島 266109；3.青島農業(yè)大學 植物醫(yī)學學院，山東 青島 266109)

幾丁質和葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，幾丁質酶通過降解菌絲生長末端新合成的幾丁質，破壞菌絲端部生長而使其頂端細胞壁變薄，繼而發(fā)生球狀突起，最后導致病原體死亡[1]，而且原生質膜破裂產生的細胞碎片具有誘導作用，進而刺激寄主植物的抗病反應[2]。因此，植物幾丁質酶在參與植物抗病反應過程中發(fā)揮著重要的作用，在正常情況下，大多數(shù)高等植物體中所含幾丁質酶基因表達水平很低，但在病原菌侵染、誘導物處理及各種傷害誘導條件下表達量顯著提高，如病原菌侵染、至少有31種病原真菌(含變種和專化型)可誘導植物幾丁質酶，病毒、類病毒[3]、細菌[4]、真菌、外源幾丁質、乙烯、重金屬、鹽溶液、機械損傷、紫外線輻射、臭氧等因素同樣具有誘導作用[5]。水楊酸(SA)也可以誘導幾丁質酶的表達，而且植物幾丁質酶的誘導是有組織特異性的，與植物的發(fā)育有關。誘導可以發(fā)生在不同的組織器官中，包括胚、種子、子葉、根、莖、葉、花和原生質體[6]。

已有研究表明，不同來源的幾丁質酶對不同病原菌及害蟲的作用效果不同。一般認為，對昆蟲的生防作用以昆蟲病原真菌源和昆蟲源的幾丁質酶為好，而有試驗表明，一些純化的細菌和植物幾丁質酶對昆蟲影響甚少。對細菌和真菌的頡抗作用以微生物源的尤其是生防菌本身的幾丁質酶基因為好[7]。從轉基因作物來源，包括了水稻、小麥、番茄、黃瓜、胡蘿卜、油菜、馬鈴薯、煙草、花生、蘋果、核桃、玫瑰等多種作物，其中以煙草最多[8](原因是它的再生和轉化非常容易，它是許多研究者首選的受體植物)。自1991年Broglie等[9]首次報道轉幾丁質酶基因的植物抗真菌病以來，已有更多的研究者轉向幾丁質酶基因的克隆與轉移。到1995年底，已有水稻、大麥、煙草等植物的幾丁質酶基因被轉入水稻、煙草、番茄等植物。Osman等[10]克隆了棉葉蟲的幾丁質酶基因，并將其轉入到玉米中，轉基因玉米對玉米螟的抗性增強。Richa 等[11]從抗水稻紋枯病菌的水稻品種中克隆了1個新的幾丁質酶基因，將其轉入到對紋枯病敏感的粳稻品系臺北309中，轉基因植株對水稻紋枯病菌的抗性增強。Marchant等[12]將水稻Ⅰ類堿性幾丁質酶基因導入栽培玫瑰中，轉基因植株對黑斑病菌的抗性增強。郭林霞等[13]將杜仲的幾丁質酶基因EuCHIT1轉入到番茄中，接菌灰霉病前轉基因番茄的POD活性高于野生型，MDA活性低于野生型；接菌后轉基因植株SOD、POD及CAT的活性分別比野生型高19.48%，116.08%，53.80%，MDA含量比野生型低37.65%；說明EuCHIT1基因過量表達增強了轉基因番茄的抗氧化能力, 對灰霉病的抗性增強。金學博等[14]從羊草中克隆獲得1種新型幾丁質酶基因LcChi2，利用農桿菌介導法成功獲得過表達的轉基因水稻，通過稻瘟病活體接種試驗證明了該基因提高了水稻的抗病性。程笑笑[15]通過同源克隆獲得大麗輪枝菌內源幾丁質酶基因VDECH，并通過原核表達獲得純化蛋白。VDECH蛋白能夠誘導植物產生初級免疫反應，引起擬南芥和棉花葉片過敏性反應，上調擬南芥和棉花防御相關基因的表達，顯著提高對主要病原菌棉花黃萎病菌的抗性。

花生在生產過程中同樣容易感染網斑病、黑斑病、銹病、黃曲霉菌等真菌性病害，嚴重影響著花生的產量和品質。因此，通過遺傳工程手段提高花生的抗病性，便成為花生抗病遺傳改良的有效途徑。

本研究擬在花生中克隆幾丁質酶基因，并通過遺傳轉化驗證其功能，創(chuàng)制抗病花生新材料，旨在為花生抗病育種提供新的基因源及新型抗病種質。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

花生(ArachishypogaeaL.)品種花育23和魯花14，質粒pCANBIA1301，大腸桿菌DH5α菌株和農桿菌EHA105菌株，均由青島農業(yè)大學花生研究中心保存；克隆載體pMD18-TSimpleVector、限制性內切酶及RNA提取、反轉錄試劑盒，均購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 體胚誘導培養(yǎng)基：MS-B5(MS 無機鹽+B5有機成分)+10 mg/L 2,4-D；體胚萌發(fā)培養(yǎng)基：MS-B5(MS無機鹽+B5有機成分)+4 mg/L 6-BAP[16]。

1.2.2 花生生長及處理 將花生品種花育23的種子用次氯酸鈉表面消毒15 min，然后接種到MS培養(yǎng)基上進行催芽，培養(yǎng)室溫度為23～25 ℃，光照強度40.5 μmol/(m2·s)，每日光照時間13 h。當幼苗長到16 d時，使用1.5 mmol/L的水楊酸噴施葉片表面處理48 h后取樣速凍，用于RNA的提取。

1.2.3 DNA提取、RNA提取及反轉錄 當幼苗長到16 d時，摘取花生尚未完全展開的嫩葉50～100 mg，迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織成粉末狀，利用CTAB法提取基因組DNA；利用RNA iso TM Plus法(TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit)，根據(jù)試劑盒說明書進行RNA提取。利用寶生物工程有限公司的反轉錄試劑盒(Prime scrip TMR Treagent bKit)，進行反轉錄獲得cDNA第1條鏈，進一步合成雙鏈cDNA備用。

1.2.4 引物設計 依據(jù)GenBank公布的花生Chi2.2(classII)基因序列(GenBank登錄號X82330)，設計1對特異性引物P1和P2，在P1的5′ 端引入BglⅡ酶切位點(下劃線表示)，P2的5′端引入BstEⅡ酶切位點(下劃線表示)。引物序列分別為P1:5′-AGATCTGGTACATCCCAAACTCAA-3′；P2:5′-GGTNACCCGCTATACTGGCTACTGCT-3′。引物由大連寶生物公司(TaKaRa)合成。

1.2.5 PCR擴增及RT-PCR擴增 分別以花生品種花育23的DNA和cDNA作為模板進行PCR擴增，PCR總反應體系(25 μL)：DNA模板(30 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，10× PCR Buffer 4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，TaqE(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 14.5 μL。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增產物膠回收，連接pMD18-T克隆并測序。

1.2.6 植物表達載體的構建 重組質粒pMD18T-Ah-Chi經限制性內切酶BglⅡ和BstEⅡ酶切，回收Ah-Chi小片段。pCAMBIA1301經同樣限制酶酶切切掉Gus基因，回收大片段，與Ah-Chi小片段連接獲得重組質粒pCAMBIA1301-Ah-Chi(圖1)。對重組質粒進行PCR擴增及BglⅡ和BstEⅡ雙酶切驗證。重組質粒pCAMBIA1301-Ah-Chi通過凍融法轉化農桿菌菌株EHA105獲得重組菌株。

圖1 植物表達載體pCAMBIA1301-Ah-Chi的構建過程(Gus基因被Ah-Chi 基因替換)Fig.1 Construction of recombinant plasmid pCAMBIA1301-Ah-Chi (Gus was substituted for Ah-Chi)

1.2.7 花生遺傳轉化 剝取花生品種魯花14成熟種子的胚小葉作為外植體，在 70% 乙醇中浸泡 10～20 s，0.1% 升汞中浸泡 8 min，無菌水沖洗3次。將胚小葉外植體接種到預培養(yǎng)培養(yǎng)基上預培養(yǎng)4 d，然后浸于EHA105農桿菌菌液(OD600=0.6～0.8)中，28 ℃，90 r/min振蕩侵染15 min。用無菌濾紙將胚小葉表面殘留菌液吸干后，再接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d。然后轉移外植體到體胚誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d，再將誘導得到的體胚轉移到體胚伸長培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3個月，期間需要繼代培養(yǎng)2～3次，用15 mg/L的潮霉素進行抗性篩選[16]。

1.2.8 轉基因植株的分子檢測 抗性再生植株利用PCR擴增法進行分子檢測及篩選，所用引物為35S啟動子序列引物：P3: 5′-GCTCCTACAAATGC CATCA-3′；P4: 5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3′, 擴增產物片段大小為195 bp。提取轉基因植株及非轉基因對照植株RNA，反轉錄成為cDNA，利用RT-PCR分析Ah-Chi的表達量，以花生肌動蛋白基因Ah-Actin作為內參基因，其擴增引物序列為：P5: 5′-GTGGCCGTACAACTGGTATTGT-3′, P6: 5′-ATGGAT GGCTGGAAGAGAACT-3′，擴增產物大小為380 bp，引物由大連寶生物公司(TaKaRa)合成。

1.2.9 轉基因植株抗病性驗證 抗病性鑒定參照Huynh等[17]的方法，將黑斑病菌(Cercosporidium

personatum)接種于試管斜面PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至菌絲在培養(yǎng)基上長滿，然后將其轉接于PDA平板培養(yǎng)基上，每個平板上放置3塊帶有霉菌的PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取轉基因植株及非轉基因對照植株頂端長勢良好且大小一致的葉片，用70% 酒精表面殺菌后放置在底部鋪有濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，其中葉片基部用沾無菌水的滅菌棉花包裹以保持花生葉片的活力。從培養(yǎng)黑斑病菌的PDA培養(yǎng)基上用打孔器取直徑為6 mm 的菌塊放置于葉片的中央(有菌絲的一面緊貼葉片表面)，每個葉片接種1個菌餅，28 ℃密封培養(yǎng)7 d后觀察葉片感染區(qū)域。

2 結果與分析

2.1 花生幾丁質酶基因的克隆

以花生品種花育23基因組DNA為模板擴增獲得1 779 bp的擴增產物(圖2-A)；以cDNA為模板通過RT-PCR獲得1條795 bp的片段(圖2-B)。序列比對結果表明，該基因包含3個外顯子和2個內含子，符合 “GT……AG”剪切規(guī)則，cDNA序列全長795 bp，編碼265個氨基酸。與GenBank中已注冊序列X82330同源性為100%，該序列已在GenBank上注冊登記(登錄號HQ439775)。

A.以DNA為模板的PCR擴增產物；B.以cDNA為模板的PCR擴增產物；M.DL2000 DNA分子量標準；1, 4.未加模板對照；2-3.DNA模板；5-6.cDNA模板。A.PCR amplification products with DNA as template; B.PCR amplification products with cDNA as template；M.DNA Marker DL2000; 1, 4. Control without DNA template; 2-3.DNA templates; 5-6.cDNA templates.

2.2 花生幾丁質酶基因進化樹分析

通過NCBI在線進行BlastP比對，發(fā)現(xiàn)Ah-Chi編碼產物與花生幾丁質酶基因X82330編碼蛋白同源關系100%，與水稻(CAA39535.1)、玉米(ALP46629.1)、苜蓿(ABX90065.1)、大豆(XP014618309.1)和擬南芥(NP181885.1)的相關蛋白的同源性分別達到83%，83%，72%，58%，49%(圖3-A)；氨基酸序列的多重比較結果顯示，這些幾丁質酶基因編碼產物之間具有較高的保守性(圖3-B)；Ah-Chi與花生野生種(Arachisduranensis,XP_015963545.1)和(Arachisipaensis,XP_016201396.1)編碼的27 ku的酸性內切幾丁質酶同源性分別為100%，98%，含有保守蛋白結構域chitinase_glyco_hydro_19，該結構域中包括約50個氨基酸的催化位點和60個氨基酸的糖結合位點(圖3-C)。

2.3 植物表達載體的構建及花生遺傳轉化

將構建的過表達載體pCAMBIA1301-Ah-Chi通過凍融法轉化農桿菌菌株EHA105獲得重組菌株。利用農桿菌介導法轉化魯花14胚小葉外植體，胚小葉外植體在體胚誘導培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)28 d后，大部分將褐化死亡，只得到小部分抗性體胚(圖4-A、B)，將抗性體胚轉移到體胚伸長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)35～42 d后體胚明顯伸長，長出葉片(圖4-C)。繼續(xù)培養(yǎng)21～28 d后可得約4～5 cm高的小苗(圖4-D)，將小苗從基部切下，利用嫁接法將再生植株移栽田間[18-19]。

2.4 轉基因植株的分子檢測

提取轉基因植株和非轉基因植株基因組DNA，采用35S引物對基因組DNA及pCAMBIA1301-Ah-Chi質粒進行擴增，結果如圖5-A所示，1號未加模板對照與3號非轉基因植株均未擴增出相應條帶，4-8號轉化植株均擴增得到了195 bp左右的目的條帶，與2號pCAMBIA1301-Ah-Chi質粒陽性對照擴增出的片段長度一致，說明重組質粒成功轉入花生。RT-PCR結果表明，1號未加模板對照未擴增出相應條帶；2號非轉基因植株與3-5號轉基因植株均擴增出Ah-Actin亮度一致的條帶；對于Ah-Chi基因，2號非轉基因植株的擴增條帶明顯比3-5號轉基因植株擴增條帶弱得多。說明轉基因植株中的Ah-Chi得到了過量表達(5-B)。

A.花生及其他高等植物幾丁質酶蛋白序列的系統(tǒng)進化樹；B.花生及其他高等植物幾丁質酶蛋白序列比對結果；C.花生幾丁質酶保守結構域預測。A.Phylogenetic tree of chitinase protein in peanut and other higher plants；B.Amino acid alignment of chitinase proteins in peanut and other higher plants;C.Chitinase conservative domain in peanut.

A～B.抗性體胚；C.經伸長培養(yǎng)35～42 d的體胚小苗；D.抗性植株。A-B.Resistant somatic embryos；C.Somatic embryo seedlings that had been elongated for 35-42 days；D.Resistant plants.

2.5 轉基因植株的抗病性鑒定

經黑斑病菌(Cercosporidiumpersonatum)接種處理轉基因陽性植株和非轉基因對照植株離體葉片7 d后，發(fā)現(xiàn)非轉基因植株葉片褐化及壞死程度較為嚴重(圖6-A)，病斑平均直徑為3.5 mm，而2個轉基因植株葉片褐化及壞死程度相對較輕(圖6-B、C)，病斑平均直徑為2.8 mm。初步說明轉化幾丁質酶基因的植株抗病性有所提高。

A.35S引物擴增檢測轉基因花生植株：M.DL2000；1.未加模板對照；2.pCAMBIA1301-Ah-Chi質粒；3.非轉基因植株；4-8.轉基因植株；B.RT-PCR擴增檢測Ah-Chi基因表達量：M.DL2000；1.未加模板對照；2.非轉基因植株；3-5.轉基因植株。

3 討論

幾丁質酶是重要的病程相關蛋白(PR蛋白)，在植物抵御真菌性病害中發(fā)揮重要作用，是植物抗病基因工程的主要研究對象。Cuero等[20]發(fā)現(xiàn)，能產毒的黃曲霉菌可誘導萌芽狀態(tài)的花生種子產生分子量約36～45 ku的幾丁質酶，因此，確定花生幾丁質酶與黃曲霉、葉斑病之間有一定的相關性[21]。Prasad等[22]利用農桿菌介導法將水稻幾丁質酶基因Rchit轉化3個花生品種獲得30個轉基因事件，轉基因植株葉片幾丁質酶活性比非轉基因對照提高2～14倍，其中來自于2個轉化事件的3個株系對晚斑病、銹病和黃曲霉病的抗性明顯增強。Iqbal等[23]將水稻幾丁質酶基因Rchit-3轉化到花生子葉中，通過離體培養(yǎng)得到轉基因植株T0，T1植株進行褐斑病(Cercosporaarachidicola)抗性測試，轉基因植株的抗病性明顯高于非轉基因對照植株。Qiao等[24]研究表明，過量表達花生β-1,3-葡聚糖基因(Ah-Glu)的轉基因植株對褐斑病菌的抗病性增強。幾丁質酶基因在植物體內以多基因家族的形式存在，Herget等[25]從花生培養(yǎng)細胞中分離出Chit1～4，并研究證實Chit2 能夠被病原菌強烈誘導。本研究結果也表明，表達花生Ah-Chi的轉基因植株對黑斑病菌的抗病性增強。幾丁質和葡聚糖都是真菌細胞壁的主要成分，幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶在抵御植物真菌性病害中具有協(xié)同效應[26]。后續(xù)研究中可將幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶這2個基因共同轉化來發(fā)揮這2個蛋白的協(xié)同作用，獲得高抗病性的轉基因植株以便更好地利用轉基因技術來增強花生對真菌病害的抵抗能力。

花生屬于較難轉化的植物，本研究利用丁霄等[16]建立的高效花生再生體系，利用農桿菌介導法，通過體胚發(fā)生途徑誘導植株再生，得到的再生植株來源于單個細胞，與傳統(tǒng)的器官發(fā)生途徑相比較，避免了再生植株是嵌合體的弊端?；ㄉM織培養(yǎng)及遺傳轉化中遇到的另外一個問題是根的再生比較困難而且生根質量較差，移栽難以成活，本研究利用郝世俊等[18]、宋汝濤等[19]發(fā)明的嫁接技術將再生苗移栽田間，大大提高了再生苗的存活率。而Iqbal等[23]利用巴基斯坦當?shù)鼗ㄉ贩NGOLDEN and BARI-2000進行遺傳轉化，在添加了0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導出較為健壯的根，這表明不同基因型的花生品種存在著生根難易的區(qū)別，花生再生及遺傳轉化體系仍需進一步優(yōu)化。

本研究結果表明，利用遺傳轉化方法在花生中過量表達自身抗病基因提高花生的抗病性是可行的，后期將結合田間試驗對這些轉基因材料進行進一步評價，為將來在政策允許條件下的田間釋放提供依據(jù)。另外，與近年所提出的聚合育種相比，單一基因轉移對作物的改良存在一定的局限性，如能將幾種抗病基因同時轉移至受體，獲得對多種病害免疫或者高抗的特殊材料，或者轉入不同來源及不同功能的基因對多個農藝性狀進行改良，培育高產優(yōu)質多抗的植物新材料、新品種，這些相關工作的有效展開將大大提高農業(yè)生產的效率。