楊 陽， 王紅麗， 高 平

(呂梁學院生命科學系，山西呂梁 033000)

影響植物的氣候因素很多，溫度是影響植物地理分布的主導(dǎo)因素，植物栽培中經(jīng)常遇到冷害凍害，低溫影響植物的生長代謝，不僅引起植物的各項相關(guān)生理指標變化，導(dǎo)致植物生長受損，甚至會導(dǎo)致植株死亡[1]。全面又深刻地認識到植物的低溫傷害機理，有助于更好地找到解決低溫傷害問題的方案[2]。目前，國內(nèi)外關(guān)于低溫脅迫的研究越來越詳細。國際上對于植物的抗寒性研究也已經(jīng)十分成熟，無論是植株、器官、細胞還是基因?qū)哟味加猩婕?。我國關(guān)于低溫脅迫對植物生理特性影響的研究最初主要集中于生理生化方面，目前逐步轉(zhuǎn)向更加深入的分子水平研究層面[2]。植株層次：植物的生長過程對溫度很敏感，低溫能影響植物的生長代謝，引起植物相關(guān)生理指標變化，導(dǎo)致植物的生長受損，嚴重時導(dǎo)致死亡。細胞層次：低溫會使細胞的柵欄組織變薄，海綿組織則變厚，同時，植物的維管束口徑增大[3]。山西地處黃土高原，冬季氣候寒冷而干燥，雨雪稀少，低溫凍害易發(fā)，耬斗菜耐旱耐寒而且管理粗放，適宜在山西大面積種植以用于綠化建設(shè)。關(guān)于耬斗菜，無論是其在園林美化中的應(yīng)用還是其生長過程中的生理特征，以及其藥用價值等方面都有人涉及并深入研究，取得不少的研究成果。如陳菲等在對低溫脅迫對耬斗菜脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白含量隨低溫脅迫程度的加深而增加[4-5]。但國內(nèi)在低溫脅迫對耬斗菜葉片形態(tài)和生理特性方面的影響尚未報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試材料為大花耬斗菜(AquilegiaglandulosaFisch.)，2016年10月定植于呂梁學院，采用海爾立式冰柜進行0～4 ℃ 低溫處理。試驗時間為2016年10月至2017年7月。

1.2 試驗設(shè)計

取6～9張葉長勢一致的耬斗菜返青植株90株，30株為一組，置于0～4 ℃的立式冰柜中低溫處理，分別在低溫處理0、7、14、21 d時取樣，以0 d的葉片形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)為對照，觀察低溫脅迫下耬斗菜葉片解剖結(jié)構(gòu)，記錄變化數(shù)據(jù)，每組重復(fù)3次。

取6～9張葉長勢一致的耬斗菜返青植株90株，30株為一組。置于0～4 ℃的立式冰柜中低溫處理，分別在低溫處理0、2、4、6、8、10 d時取樣，以0 d的大花耬斗菜葉片的各項生理指標為對照，測定葉綠素、脯氨酸、丙二醛與可溶性蛋白的含量[6]，每組重復(fù)3次。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 葉片形態(tài)指標測定方法 耬斗菜葉片形態(tài)觀察：直接觀察葉片生長形態(tài)及顏色，用RHS植物比色卡進行比較，并做記錄。耬斗菜葉片氣孔密度和氣孔開度的測定及計算：將做好的大花耬斗菜徒手切片，在生物顯微鏡下觀察，低倍鏡視野，再高倍鏡觀察，拍照記錄氣孔個數(shù)，顯微測微尺測量氣孔大小、開度，記錄數(shù)據(jù)，計算氣孔密度。計算公式：視野的面 積=π×半徑2；氣孔密度=視野中氣孔的個數(shù)/視野的面積。

耬斗菜葉片柵海組織厚度的測定及柵海比的計算：選取大花耬斗菜葉片橫切石蠟切片[7]，在生物顯微鏡下，先低倍鏡視野觀察，再換高倍鏡觀察并拍照記錄，利用顯微測微尺測量柵欄、海綿組織的厚度，計算柵海比。柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度。

耬斗菜葉片維管束口徑的測定：選取大花耬斗菜葉片靠近葉柄的部位做橫切石蠟切片，在顯微鏡下觀察，先用低倍鏡找到觀察的視野并拍照記錄，再換高倍鏡觀察并拍照記錄，用顯微測微尺測量維管束口徑，并記錄數(shù)據(jù)。氣孔觀察與測定：取大花耬斗菜基生葉下表皮的徒手切片，觀察葉片氣孔并測量有關(guān)數(shù)據(jù)(氣孔密度、氣孔大小、氣孔開度)。

1.3.2 生理生化指標測定方法及計算 采用丙酮乙醇法測定葉綠素含量[8]；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[9-10]；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量[11-13]，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[10]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)的錄入和數(shù)據(jù)庫的建立以及數(shù)據(jù)圖表的制作，采用SPSS進行方差分析及顯著性檢測[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對耬斗菜葉色的影響

對比RHS植物比色卡，低溫處理0 d葉片呈墨綠色，低溫處理7 d后葉片呈草綠色，低溫處理14 d后葉片邊緣干枯，葉肉細胞呈嫩綠色，葉脈呈草綠色，低溫處理21 d后，葉片邊緣卷曲，葉肉細胞呈黃色，葉脈仍呈草綠色。分析可得，低溫脅迫影響耬斗菜葉色，使其從墨綠色逐漸變成黃色，且對葉肉顏色影響明顯，葉片顏色呈現(xiàn)與葉肉和葉脈不同的色澤。

2.2 低溫脅迫對耬斗菜葉片氣孔密度和開度的影響

耬斗菜葉片上表皮幾乎沒有氣孔分布。下表皮中，常溫下的耬斗菜葉片氣孔明顯多于低溫脅迫后的葉片。表1顯示，隨著低溫脅迫時間的延長，氣孔密度顯著減小，其中氣孔密度在低溫脅迫7 d與正常環(huán)境下植株差異不顯著，低溫脅迫14、21 d氣孔密度與正常環(huán)境下植株差異顯著，從 30個/mm2降低到12個/mm2。低溫脅迫對耬斗菜葉片氣孔橫徑無顯著影響，低溫脅迫14、21 d氣孔縱徑有變化，但與常溫下植株差異不顯著。低溫脅迫對耬斗菜葉片氣孔開度有顯著影響，低溫脅迫21 d氣孔開度與常溫下植株相比顯著降低。

表1 低溫脅迫下下表皮氣孔比較

注：同列數(shù)值后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下表同。

2.3 低溫脅迫對耬斗菜葉片柵欄組織、海綿組織厚度的影響

從表2可以看出，低溫脅迫對耬斗菜葉片解剖結(jié)構(gòu)影響顯著。隨著脅迫時間的延長，大花耬斗菜葉片柵欄組織厚度顯著減小，從14.20 μm減小到6.01 μm，而海綿組織厚度顯著增大，從8.51 μm增大到 12.00 μm，柵海比則顯著減小。

2.4 低溫脅迫對耬斗菜葉片維管束口徑的影響

維管束在植物體中承擔著運輸水分和營養(yǎng)的作用。從表3中可以看出，在低溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，耬斗菜葉片維管束口徑顯著增大，從1.20 μm增長到3.26 μm。低溫處理0 d的維管束口徑顯著小于低溫處理7、14、21 d的維管束口徑。低溫脅迫處理21 d，維管束口徑最大，達到 (3.26±0.26) μm。

表2 低溫脅迫對耬斗菜葉片柵海組織的影響

表3 低溫脅迫對維管束口徑的影響

2.5 低溫脅迫對耬斗菜葉片葉綠素含量的影響

從圖1可看出，低溫脅迫下植株葉片的葉綠素含量低于常溫下植株的葉綠素含量，并且隨著低溫脅迫時間的延長，葉綠素含量逐漸下降。而脅迫8 d后，葉綠素含量又逐漸上升。

2.6 低溫脅迫對耬斗菜葉片可溶性蛋白含量的影響

從圖2可看出，隨著脅迫時間的延長，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢。低溫脅迫2 d后，耬斗菜葉片可溶性蛋白含量略高于常溫下處理的葉片，低溫脅迫4 d后，可溶性蛋白含量逐漸降低，至脅迫6 d達到最低，脅迫8 d可溶性蛋白含量有所增加，但仍低于常溫下處理的耬斗菜葉片。

2.7 低溫脅迫對耬斗菜葉片脯氨酸含量的影響

從圖3可看出，隨著脅迫時間的延長，耬斗菜葉片脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢。低溫脅迫前4 d，耬斗菜葉片脯氨酸含量升高，且高于常溫下葉片，低溫脅迫4 d后，脯氨酸含量逐漸降低，至脅迫10 d時有所回升，且脯氨酸含量略高于常溫下的處理。

2.8 低溫脅迫對耬斗菜葉片丙二醛含量的影響

從圖4可看出，隨著低溫脅迫時間的延長，丙二醛含量呈現(xiàn)波動，先升高后降低再升高。低溫處理前4 d，丙二醛含量逐漸升高，4～6 d丙二醛含量降低，6 d后又逐漸升高[14]。

3 討論

本研究以大花耬斗菜為試驗材料，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下葉片從墨綠色變?yōu)辄S色，氣孔變小，柵欄組織厚度減小，海綿組織厚度和維管束口徑增大，各項生理指標發(fā)生變化，充分說明了耬斗菜對低溫的適應(yīng)性，也符合大部分植物對低溫的適應(yīng)性。之前的報道表明，具有較強抗寒性的植物的葉解剖結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)柵欄組織增厚且排列緊密的現(xiàn)象，而本試驗中柵欄組織厚度雖呈現(xiàn)減小的趨勢，但細胞排列比常溫下緊密。氣孔密度、氣孔大小、氣孔開度是植物調(diào)節(jié)自身蒸騰作用的反應(yīng)。氣孔減少在一定程度上會導(dǎo)致植物光合作用降低，氣孔開度減小使植物蒸騰作用降低，從而使植物生理機能降低，達到保護自我的目的，也充分證明了耬斗菜有抗寒能力。但由于沒有繼續(xù)加長跟蹤測定大花耬斗菜氣孔密度、氣孔大小及氣孔開度的處理時間，故無法判斷大花耬斗菜植株的耐寒范圍。

植物的生命活動離不開光合作用，植物為了抵御低溫，各項生命活動速率都會在一定程度上降低，從而導(dǎo)致植物葉綠素含量降低。大花耬斗菜葉綠素含量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢，但上升趨勢并不顯著，這一趨勢與文獻結(jié)果相一致。但由于沒有繼續(xù)加長處理時間跟蹤測定，故無法判斷大花耬斗菜植株的耐寒范圍。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，可以以小分子狀態(tài)溶于水或其他溶劑，其增加和積累能提高細胞的保水能力，從而使植物能夠更好地抵抗低溫脅迫對自身造成的不良影響[6，8，10，16-17]。在低溫脅迫2 d時，大花耬斗菜植株可溶性蛋白含量升高，2 d后開始下降，6 d后又逐漸上升，與查閱文獻結(jié)果一致。游離脯氨酸是構(gòu)成植物蛋白質(zhì)的一種重要氨基酸。低溫脅迫0～4 d時，脯氨酸含量逐漸升高，4 d后逐漸降低，至脅迫10 d時又有所回升，且略高于常溫處理。丙二醛是植物膜脂受活性氧作用產(chǎn)生的物質(zhì)，是過氧化物的最終分解產(chǎn)物，丙二醛的大量積累會破壞植物細胞膜，對植物的生理活性造成毒害，其含量越多，細胞膜脂過氧化的程度就越大，植物受傷越嚴重[6，8，18-20]。在低溫脅迫2～4 d時，大花耬斗菜植株丙二醛含量一直呈現(xiàn)上升趨勢，4 d后開始下降，6 d后又呈現(xiàn)上升趨勢。

另外，試驗中各項生理指標均呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢，推測可能是試驗中所取材料的差異導(dǎo)致，最后2次取材時所選材料是長出的新葉，而前面取材時選用的葉片是老葉，從而使最后2 d所測得的生理指標均呈現(xiàn)上升趨勢。