王 鵬， 王丹丹

(遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118003)

艷紅桃(PrunuspersicaL.)為多年生果樹，原產(chǎn)于我國，主要集中在黃河及長江流域。桃果實為躍變型果實，其呼吸強度的變化模式是在果實發(fā)育定型之前，呼吸強度不斷下降，在成熟開始時，呼吸強度會驟然升高，達到峰值后便快速下降，同時，在呼吸躍變期間，果實體內(nèi)生理代謝發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變，是果實由成熟向衰老轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)折點，因此，躍變型果實貯運時，要在呼吸躍變出現(xiàn)前進行采收[1-3]。

躍變型果實對乙烯很敏感，它的成熟需乙烯催化，而桃不同于其他典型的躍變型果實，其在成熟期間內(nèi)源性乙烯產(chǎn)生較少，因此，種植者為了加快采收后桃的成熟，進而產(chǎn)生更高的商業(yè)價值，大多采用乙烯利處理果實；但如果果實能在枝上成熟，則其可能更有市場、更受消費者的歡迎[4]。

脫落酸(abscisic acid，簡稱ABA)為植物生長發(fā)育過程中重要的內(nèi)源調(diào)控因子，低濃度可促進果實成熟，高濃度可抑制果實成熟[5-7]；ABA在未成熟的躍變型果實(如桃子、西紅柿等)中濃度較低，但果實成熟時其濃度會增加，可見，ABA在調(diào)節(jié)躍變型果實成熟過程中起關(guān)鍵作用；研究表明，ABA參與了西紅柿中乙烯的大量合成并加速其果實的成熟，乙烯生物合成途徑首先是由甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，簡稱SAM)，SAM在1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclo propane-1-carboxylic acid，簡稱ACC)合酶的作用下合成ACC，ACC在ACC氧化酶作用下生成乙烯[8-11]，而外源ABA處理果實可提高ACC合成酶和ACC氧化酶的活性，使乙烯釋放量增加，促進乙烯釋放高峰期的出現(xiàn)；ACC合成酶(1-aminocycl propane-1-carboxylic acid synthase，簡稱ACS)在乙烯合成過程中催化S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adometsynthetase，簡稱SAMS)合成ACC，是乙烯合成過程中的限速酶。去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid，簡稱NDGA)可抑制ACC合酶和ACC氧化酶的活性，從而降低乙烯的釋放量并使乙烯釋放高峰延緩出現(xiàn)，其不僅能阻斷脅迫誘導(dǎo)的ABA積累，又能抑制ABA在果實中的合成，其抑制程度隨濃度升高而增強，NDGA抑制ABA的合成是通過抑制9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，簡稱NCED)的含量與活性實現(xiàn)的，而NCED能夠促進ABA的合成，是高等植物內(nèi)源性ABA合成過程中關(guān)鍵的限速酶[12-13]。

目前，專家們對植物內(nèi)源激素乙烯、ABA對果實成熟的調(diào)控作用以及二者的相互關(guān)系做了大量的研究工作，但關(guān)于乙烯和脫落酸對采收前果實成熟作用的研究較少。本試驗采用250 μL/L乙烯利、100 μmol/L ABA和100 μmol/L NDGA處理采收前盛花90 d的艷紅桃果實，并取樣分析；采用實時定量PCR技術(shù)分析PpNCED2基因的表達水平，并構(gòu)建艷紅桃PpNCED2與其他植物NCED的系統(tǒng)發(fā)育樹，以期加快未采收果實的熟化過程，使果實提前進入市場。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以4～6年生的艷紅桃為研究對象，源自遼寧省丹東市寬甸果園，各植株生長健壯且樹勢基本一致。試驗設(shè)4組，每組隨機選取70個90 d(盛花后天數(shù)，days after full bloom，以下簡稱DAFB)艷紅桃果實，以果皮顏色開始變化開始；第1組將枝上果實浸泡于250 μL/L乙烯利和5%乙醇溶液中 1 min；第2組將枝上果實浸泡于100 μmol/L ABA與5%乙醇溶液中1 min；第3組將枝上果實浸泡于100 μmol/L NDGA與5%乙醇溶液中1 min；第4組將枝上果實浸泡于5%乙醇溶液中1 min，作為對照組；經(jīng)上述處理后分別在0、2、4、6、8、10、12 d時采收果實，每次每組采收10個果實，對果實硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量及乙烯釋放量進行測定；此外，將部分果肉存于液氮中，用于提取RNA及分析ABA濃度等。

1.2 果實硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量的測定

果實硬度采用FT-327型果實硬度計測定；可溶性固形物含量采用LH-B55手持測糖儀測定；可滴定酸含量采用水果酸度計檢測。

1.3 ACS、ACO活性與ACC濃度、乙烯釋放量和ABA濃度的測定

ACS、順烏頭酸酶(aconitase，簡稱ACO)活性與ACC濃度、乙烯釋放量的測定均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA試劑盒)，其中桃果實內(nèi)源ABA提取、純化按照Silva等的方法進行[14]。

1.4 PpNCED2基因的實時定量PCR分析

分別將各組樣本于液氮中研磨成粉，用于提取總RNA，采用植物總RNA抽提試劑盒提??；采用SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase試劑盒對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR體系參照2xSG Fast QPCR Master Mix試劑盒。采用PrimerExpress軟件設(shè)計基因PpNCED2實時熒光定量PCR引物，同時設(shè)計內(nèi)參基因Elongationfactor-1α的引物(表1)。QRT-PCR體系共20 μL：RT-PCR mixture 10.0 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA(50～100 ng/μL)2.0 μL，ddH2O 7.0 μL；反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，50 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。本試驗所有試劑及引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.5 構(gòu)建PpNCED2基因系統(tǒng)發(fā)育樹

采用NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫搜索PpNCED2的近緣基因；并采用DNAMAN 8.0軟件分析程序(Lynnon Biosoft，美國)進行PpNCED2與其他NCED基因的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進行統(tǒng)計、作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗處理對艷紅桃品質(zhì)的影響

由圖1可知，乙烯利處理后4 d，果實的硬度明顯低于其他組，且處理后10 d果實已可食用，其他3組果實硬度無明顯變化；可溶性固形物含量在乙烯利處理后的4 d明顯增加；可滴定酸含量在乙烯利處理后下降明顯；其中，12 d時，經(jīng)過處理的果實中，可溶性固形物含量明顯高于對照組；采用乙烯利處理后10 d，果實已可食用，但落果率僅為5%，明顯優(yōu)于其他處理方式；而采用ABA處理的果實落果率與對照組無明顯差異，采用NDGA處理的果實在處理后12 d時開始落果，較其他組慢。

2.2 試驗處理對艷紅桃乙烯代謝的影響

由圖2可知，ACC含量在采用乙烯利處理后10 d達到最高值，而后迅速下降；采用ABA處理后6 d， ACC較其他3組低，此后，ABA、NDGA以及對照組ACC含量無較大差異。采用乙烯利、ABA和NDGA處理后10 d，ACO活性均整體增強，此后活性下降，其中采用乙烯利處理ACO活性增強效果明顯，而對照組在處理后6 d便有下降趨勢。乙烯利處理下，ACS活性在處理后6 d呈明顯增強趨勢，在處理后10 d達到峰值，而后略有下降，但較其他3組增強效果明顯。采用乙烯利處理后2～10 d，乙烯釋放量較其他3組明顯增加，在處理后10 d達到最高值，而后有迅速下降趨勢。可見，采用乙烯利處理果實，ACC含量、ACO活性增強效果明顯，有利于桃果實內(nèi)源乙烯的合成，從而加快果實的熟化速度。

2.3 試驗處理對ABA濃度及PpNCED2表達水平的影響

由圖3可知，PpNCED2基因的表達水平，在采用ABA處理后4、6 d明顯增加，乙烯利處理后PpNCED2基因略有表達，其他2組表達水平不明顯。采用外源性ABA處理艷紅桃果實，檢測到的內(nèi)源性ABA濃度均高于其他3組，而采用乙烯利處理果實，檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性ABA的釋放與對照組相比未見明顯變化?？梢?，NCED能夠促進內(nèi)源ABA合成，是高等植物內(nèi)源性ABA合成過程中關(guān)鍵的限速酶。

2.4 構(gòu)建PpNCED2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

采用DNAMAN 8.0軟件對艷紅桃PpNCED2基因全長序列進行分析，對艷紅桃與其他12種植物NCED基因編碼的氨基酸進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖4可見，艷紅桃PpNCED2與沙梨PpNCED3同源性較高(91.25%)，將二者的氨基酸序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列相似度較高，僅在N端區(qū)域有較小差異；說明NCED基因是大部分植物ABA合成過程中的關(guān)鍵酶基因。

3 結(jié)論

乙烯是植物的一種內(nèi)源激素，雖然結(jié)構(gòu)簡單，但參與植物發(fā)育過程的很多階段，包括細胞延長、種子萌發(fā)、果實成熟、器官衰老、根的結(jié)瘤、程序性細胞死亡、脫落、對環(huán)境脅迫的響應(yīng)和病原體的侵染等；肉質(zhì)果實的成熟表現(xiàn)為發(fā)育過程和生化通路的協(xié)調(diào)作用，這些作用可導(dǎo)致果實顏色、質(zhì)地的改變、營養(yǎng)成分的積累、香氣的產(chǎn)生以及種子的形成等。乙烯在許多果實的成熟中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如芒果、香蕉、梨和西紅柿等，可通過促進乙烯的合成來達到對躍變型果實成熟的調(diào)控。

本試驗結(jié)果顯示，艷紅桃果實采收前，采用乙烯利處理桃果實，可快速降低果實硬度、增加果實可溶性固形物含量，可見，乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能加快淀粉轉(zhuǎn)化為糖的速度，同時減少可滴定酸的含量。此外，使用外源性ABA可誘導(dǎo)PpNCED2基因的表達，增加內(nèi)源性ABA的濃度，可見，ABA能夠激活NCED基因的表達，而該基因是ABA合成途徑中關(guān)鍵酶基因的上游調(diào)控因子，但果實的硬度、可滴定酸的含量等與對照組相比并無較大差異。綜上所述，在果實熟化過程中，乙烯的調(diào)控占主導(dǎo)地位，乙烯能刺激細胞膜透性增加，使呼吸作用加快，促使果肉內(nèi)有機物的強烈轉(zhuǎn)化，以達到可食的程度，如果沒有乙烯，成熟過程無法完成，果實味道變差。Zaharah等報道，芒果呼吸躍變期，ABA的大量積累能夠促進果實熟化過程中乙烯的釋放量的增加；成熟發(fā)生時，ACO的活性迅速升高，接著又急劇下降，隨著躍變的發(fā)生，ACO含量升高，且在之后的成熟過程中依然維持一個相對較高的量，盡管ACO含量已快速下降；而ABA通過增強ACS、ACO的活性和ACC的積累，加快乙烯生物合成的效果[15]。

綜上所述，采收前，采用乙烯利處理桃果實能夠加快果實的軟化，增加可溶性固形物的含量，減少可滴定酸的含量；并且在乙烯利處理后10 d，果實即可食用，而落果率僅為5%，明顯優(yōu)于其他幾種處理方式；因此，采收前，可采用乙烯利處理桃果實，以加快果實成熟，提早進入市場，提高經(jīng)濟效益。但是，乙烯也是一把雙刃劍，既能促進高品質(zhì)果實的產(chǎn)生，也能在果實成熟后期刺激果實過度成熟甚至腐爛，因此，未來通過控制乙烯的生物合成或乙烯的響應(yīng)以阻止或延緩果實的成熟在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)都尤為重要。