陳嘉蔚，趙培靜，鄧錦波，李姣清，明飛平，張淑霞，盧悄佳，張玲華

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.廣州市微生物研究所，廣東 廣州 510663）

細(xì)菌通過(guò)稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）的機(jī)制響應(yīng)細(xì)菌群體密度變化，進(jìn)而調(diào)控目的基因的表達(dá)。細(xì)菌分泌一種小分子自誘導(dǎo)物（Autoinducer，AI），該信號(hào)物質(zhì)可以通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，當(dāng)其濃度隨細(xì)菌密度增加而提高到一個(gè)臨界濃度時(shí)，細(xì)菌群體就能響應(yīng)信號(hào)分子表現(xiàn)出某些生物學(xué)功能，以適應(yīng)環(huán)境變化，為種群爭(zhēng)取更大的優(yōu)勢(shì)［1-2］。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）是細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子，它在革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中普遍存在，調(diào)控多種致病菌毒力因子、胞外多糖和抗生素的表達(dá)，促進(jìn)生物膜形成和孢子產(chǎn)生，強(qiáng)化自身群體與其他細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物的生存競(jìng)爭(zhēng)［3］。當(dāng)AHLs濃度達(dá)到閾值，能激活致病基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)菌性軟腐病、青枯病、真菌侵染、灰霉病等疾病，嚴(yán)重危害經(jīng)濟(jì)作物［4-6］。幾種土壤細(xì)菌可以通過(guò)酶降解AHLs來(lái)干擾QS，該現(xiàn)象被稱為群體淬滅［7］。大部分芽胞桿菌可以通過(guò)自誘導(dǎo)物失活（Autoinducer inactivation，AiiA）蛋白水解AHLs的內(nèi)酯環(huán)，從而破壞細(xì)菌的QS系統(tǒng)，減弱其產(chǎn)生的危害［8］。因此，利用AiiA蛋白降解AHLs分子來(lái)防治細(xì)菌性植物病害的研究也逐漸展開(kāi)，目前AHLs的降解已被證明是控制植物細(xì)菌性感染的有效方法［9-11］。

然而，由于芽孢桿菌表達(dá)的AiiA蛋白是一種胞內(nèi)蛋白，表達(dá)水平較低，也不能分泌到胞外對(duì)環(huán)境中的AHLs分子進(jìn)行降解，因此目前國(guó)內(nèi)外對(duì)提高AiiA蛋白的表達(dá)量及活性研究主要包括兩大方向：構(gòu)建外源高效分泌表達(dá)AiiA蛋白的工程菌以及將aiiA基因轉(zhuǎn)化植株，但aiiA基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人體的影響尚不清楚，歐陽(yáng)樂(lè)軍等成功構(gòu)建了aiiA基因的植物表達(dá)載體 pCAM-aiiA，總體而言轉(zhuǎn)aiiA植物的研究相對(duì)較少［12-13］。目前，AiiA蛋白已經(jīng)在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)中得到了表達(dá)，如大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)［14-16］。但大腸桿菌異源性表達(dá)目的蛋白容易形成包涵體等缺點(diǎn)使其研究及在工農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用受到一定限制。研究發(fā)現(xiàn)，不同表達(dá)系統(tǒng)的aiiA基因存在密碼子偏好性差異，其中芽胞桿菌aiiA基因與畢赤酵母差異較大，如需實(shí)現(xiàn)aiiA基因的高效表達(dá)必須進(jìn)行密碼子突變或者進(jìn)行全序列同義合成［17-18］。本研究從枯草芽孢桿菌中擴(kuò)增胞苷脫氨酶（CDD）基因的啟動(dòng)子P43以及aiiA基因，采用搭橋PCR的方法將P43強(qiáng)啟動(dòng)子連接到aiiA基因上游，構(gòu)建P43-aiiA-C11重組枯草芽孢桿菌，重組菌株具有良好的降解AHLs能力，對(duì)將AiiA蛋白應(yīng)用于農(nóng)作物病害防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌（E. coli）DH5α、根 癌 農(nóng) 桿 菌（Agrobacterium tumefaciens）NTL4（pZLR4）（含traG-lacZ融合基因和traR基因，羧芐青霉素抗性，慶大霉素抗性）、根癌農(nóng)桿菌 NTL4 （pTiC58ΔaccR，含traI基因）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）C11（該菌株是本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)大量田間實(shí)驗(yàn)分離篩選得到的具有良好預(yù)防青枯病致病菌作用的生防菌株）；pMD20-T載體購(gòu)于大連寶生物公司，pHY300PLK枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.2 工具酶及其他試劑XbaⅠ、EcoRⅠ等限制性內(nèi)切酶、pfu高保真酶、Taq聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司；羧芐青霉素（Car）、慶大霉素（Gm）等抗生素購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)NCBI上已公布的枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子序列（EF473728.1）以及aiiA基因序列（DQ000640.1），設(shè)計(jì)2對(duì)引物（Primer 1/2、Primer 3/4） ，引物由上海生工公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增P43啟動(dòng)子與aiiA基因 以本實(shí)驗(yàn)室從枯草芽孢桿菌總DNA中擴(kuò)增得到的P43啟動(dòng)子和aiiA基因?yàn)槟０?，以Primer 1/2和Primer 3/4為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10× pfu buffer 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，引物 Primer 1/2 或 Primer 3/4（10 pmol/L）各1 μL，pfu酶0.5 μL，模板1 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，（94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min）×30循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.2 搭橋PCR連接P43啟動(dòng)子與aiiA基因PCR反應(yīng)得到的啟動(dòng)子P43擴(kuò)增片段3’端帶有aiiA擴(kuò)增片段的第1～20個(gè)堿基，aiiA基因擴(kuò)增片段5’端帶有P43擴(kuò)增片段的15個(gè)堿基。將PCR反應(yīng)得到的P43啟動(dòng)子與aiiA基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后混合，用Primer 1和Primer 4進(jìn)行PCR擴(kuò)增（具體流程見(jiàn)圖1）。PCR反應(yīng)體系：10× pfu buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL， 引 物Primer 1、Primer 4（10 pmol/L）各 2.5 μL，pfu 酶0.5 μL，P43與aiiA擴(kuò)增回收產(chǎn)物各1 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，（94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸2 min）× 30循環(huán)，72℃延伸10 min。

圖1 搭橋PCR擴(kuò)增P43-aiiA

1.2.3 構(gòu)建P43-aiiA-pHY300PLK重組質(zhì)粒 將PCR擴(kuò)增得到的P43-aiiA片段純化回收后與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α后進(jìn)行菌落PCR與雙酶切鑒定并提取質(zhì)粒送測(cè)序，鑒定正確后利用XbaⅠ、EcoRⅠ對(duì)P43-aiiA片段和pHY300PLK載體進(jìn)行雙酶切，純化回收后進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α進(jìn)行鑒定與測(cè)序，重組質(zhì)粒命名為P43-aiiA-pHY300PLK（具體流程見(jiàn)圖2）。鑒定正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌C11。

圖2 P43-aiiA-pHY300PLK重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.4 驗(yàn)證AiiA酶活性 AiiA酶活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)［19］的方法并略作改進(jìn)。用根瘤農(nóng)桿菌NTL4（pZLR4）作為指示菌檢測(cè)長(zhǎng)?；淎HLs，該菌株攜帶含有traR和traG-lacZ融合基因的質(zhì)粒pZLR4，長(zhǎng)?；淎HLs可誘導(dǎo)traR蛋白的轉(zhuǎn)錄，激活traG-lacZ融合基因的表達(dá)，β-半乳糖苷酶的活性可用于traG轉(zhuǎn)錄的報(bào)告［20-21］。根癌農(nóng)桿菌 NTL4 （pTiC58ΔaccR）含有traI基因，其編碼traI蛋白可以大量合成AHLs分子［22］。將根癌農(nóng)桿菌NTL4（pTiC58ΔaccR）的16 h培養(yǎng)液離心，取上清過(guò)濾除菌，按2%接菌至過(guò)濾上清液，接野生型枯草芽孢桿菌C11作陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照用新鮮YEP培養(yǎng)液接待測(cè)菌，培養(yǎng)過(guò)夜后，離心取上清液作樣品。

檢測(cè)方法一：取上清液10 μL加至含X-gal的條狀YEP瓊脂培養(yǎng)基，待上清液基本被培養(yǎng)基吸收后，在樣品下方均勻點(diǎn)接指示菌NTL4（pZLR4），每個(gè)0.8 μL，28℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果（具體操作見(jiàn)表2），待測(cè)樣品點(diǎn)樣處與最遠(yuǎn)的藍(lán)色菌落的距離若小于陰性對(duì)照，表明該樣品具有AiiA活性。

檢測(cè)方法二：將指示菌NTL4（pZLR4）涂布至含X-gal的YEP平板，取樣品上清液10 μL加至平板上，28℃培養(yǎng)24 h后觀察試驗(yàn)結(jié)果，待測(cè)樣品點(diǎn)樣處藍(lán)色菌落范圍若小于陰性對(duì)照，表明該樣品具有AiiA活性，范圍越小則AiiA活性越高。

表2 驗(yàn)證AiiA活性流程

2 結(jié)果與分析

2.1 P43啟動(dòng)子與aiiA基因的克隆

通過(guò)PCR擴(kuò)增出帶酶切位點(diǎn)的P43啟動(dòng)子與aiiA基因片段大小分別應(yīng)為308 bp和776 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，但P43啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物有非特異條帶（圖3），對(duì)P43啟動(dòng)子與aiiA基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。

圖3 P43啟動(dòng)子與aiiA基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒P43-aiiA-pHY300PLK的構(gòu)建

通過(guò)SOE PCR擴(kuò)增得到的P43-aiiA片段應(yīng)為1 069 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖4）。

圖4 P43-aiiA片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

將P43-aiiA片段與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α后進(jìn)行菌落PCR鑒定并提取質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確；對(duì)P43-aiiA片段和pHY300PLK質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切與連接，并轉(zhuǎn)化DH5α進(jìn)行鑒定與測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌C11，進(jìn)行菌落PCR與雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，菌落PCR擴(kuò)增條帶大小與雙酶切片段大小都與預(yù)期結(jié)果相符（圖5），重組菌株命名為P43-aiiA-C11。

2.3 AiiA酶活驗(yàn)證

AiiA活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6A，陰性對(duì)照中指示菌NTL4（pZLR4）幾乎全部變藍(lán)，只有最下端菌落藍(lán)色較淺；3個(gè)平行試驗(yàn)的指示菌至條狀培養(yǎng)基中間藍(lán)色開(kāi)始變淺，至下端全部為白色菌落。由圖6B可知，平板上試驗(yàn)組藍(lán)色擴(kuò)散范圍（25 mm）比陰性對(duì)照（15 mm）小，而陽(yáng)性對(duì)照中均為白色菌落。說(shuō)明農(nóng)桿菌NTL4（pTiC58ΔaccR）培養(yǎng)液上清中含有AHLs分子，而實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的P43-aiiA-C11菌株具有高于野生型C11菌株的淬滅酶活性，能明顯降解信號(hào)分子。

圖6 P43-aiiA-C11菌株AiiA酶活驗(yàn)證

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)成功擴(kuò)增P43啟動(dòng)子和aiiA基因的聯(lián)合片段P43-aiiA，構(gòu)建含有P43啟動(dòng)子和aiiA基因的穿梭載體P43-aiiA-pHY300PLK，并成功導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中表達(dá)。與野生型菌株相比，構(gòu)建菌株P(guān)43-aiiA-C11表達(dá)產(chǎn)物具有顯著的降解AHLs能力，為構(gòu)建防治植物病害的基因工程菌株帶來(lái)了新方向，對(duì)減少農(nóng)作物致病因素具有重要意義。

AiiA蛋白能夠降解革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的信號(hào)分子AHLs，從而抑制致病菌的生長(zhǎng)以及致病基因的表達(dá)，達(dá)到生物防治的效果。但天然AiiA蛋白的表達(dá)量較低，溫真等［23］用aiiA基因的啟動(dòng)子代替pET-28a中的T7啟動(dòng)子，經(jīng)熒光顯微鏡鏡觀察，發(fā)現(xiàn)aiiA基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度并不是很強(qiáng)，較新的研究表明aiiA啟動(dòng)子中還包含負(fù)調(diào)控序列［24］。為了提高AiiA蛋白的表達(dá)量，吳懷光等［25］利用蘇云金芽孢桿菌S-層蛋白基因與殺蟲(chóng)晶體蛋白基因cry3Aa啟動(dòng)子與aiiA基因融合表達(dá)，得到了能高效和穩(wěn)定表達(dá)AiiA蛋白的蘇云金芽孢桿菌菌株。曾世涌等［26］利用枯草芽孢桿菌eglS基因的啟動(dòng)子與信號(hào)肽序列在枯草芽孢桿菌中表達(dá)蘇云金芽孢桿菌aiiA基因，表達(dá)的AiiA蛋白對(duì)胡蘿卜歐文氏桿菌表現(xiàn)出一定的抗病性。陳珺君等［27］利用野生型多黏芽胞桿菌表達(dá)蘇云金芽胞桿菌aiiA基因，結(jié)果表明AiiA蛋白對(duì)胡蘿卜歐文氏菌具有抗病活性，但不具有抑菌活性。然而，在天然環(huán)境下，異源性表達(dá)無(wú)可避免會(huì)遇到密碼子偏好性差異的問(wèn)題，影響目的基因的表達(dá)。2007年P(guān)an等［28］首次從枯草芽孢桿菌中克隆得到aiiA基因，因此本研究選用枯草芽孢桿菌C11作為表達(dá)菌株表達(dá)枯草芽孢桿菌aiiA基因，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、容易培育的優(yōu)點(diǎn)，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，利用枯草芽孢桿菌表達(dá)的重組蛋白大多具有生物活性和維持天然結(jié)構(gòu)，枯草芽孢桿菌也是目前應(yīng)用較廣的微生物殺菌劑之一。

本研究通過(guò)搭橋PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子P43以及aiiA基因的聯(lián)合片段，連接穿梭載體pHY300PLK轉(zhuǎn)化草芽孢桿菌。P43是組成型啟動(dòng)子，研究發(fā)現(xiàn)P43啟動(dòng)子在枯草桿菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)前期已開(kāi)始表現(xiàn)活性，隨后轉(zhuǎn)錄活性迅速提高，有利于AiiA蛋白在天然環(huán)境下持續(xù)性表達(dá)［29-30］。Wan等［31］通過(guò)啟動(dòng)子替換構(gòu)建pMA0911-P43-PUL，在同等條件下測(cè)定支鏈淀粉酶最高酶活可提高2倍。本研究利用指示菌NTL4（pZLR4）在AHLs存在的條件下能在含有X-gal平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落的原理，通過(guò)在條狀培養(yǎng)基上點(diǎn)接指示菌和在平板上涂布指示菌，均驗(yàn)證P43-aiiA-C11菌株對(duì)AHLs信號(hào)分子具有明顯淬滅活性。而AiiA蛋白不含信號(hào)肽［32］，研究工作將進(jìn)一步提高AiiA蛋白的分泌表達(dá)，增強(qiáng)其在土壤環(huán)境中降解AHLs分子的效力。