張坤，呂旭，曹蘇生

新輔助化療治療局限性進(jìn)展期乳腺癌療效顯著，它能使腫塊萎縮，積極創(chuàng)造手術(shù)條件[1]。新輔助化療的病理緩解率約30%，臨床緩解率約60%[2]。已有較多文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌化療失敗原因[3-4]，但尚未篩選到療效預(yù)測(cè)因子。CDK8是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，通過(guò)介導(dǎo)癌細(xì)胞和干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄控制途徑，維持腫瘤細(xì)胞去分化狀態(tài)和胚胎干細(xì)胞全能性[5]。CD133是含有5個(gè)跨膜區(qū)域的單鏈糖蛋白，主要在干細(xì)胞、祖細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞表達(dá)。本研究通過(guò)檢測(cè)CDK8與CD133在新輔助化療前后的表達(dá)情況，探討其在乳腺癌新輔助化療療效評(píng)價(jià)中的預(yù)測(cè)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年1月至2017年12月，徐州市中心醫(yī)院乳腺外科TNM分期Ⅱ、Ⅲ期的原發(fā)性乳腺癌患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 組織病理確診為乳腺癌；② 年齡20～60歲；③ 首次發(fā)??；④ 檢查肺、肝、骨、腦未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；② 合并肝腎功能重度損害；③ 合并嚴(yán)重心、腦血管疾病。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 超聲引導(dǎo)下粗針穿刺，經(jīng)病理確診后，根據(jù)免疫組化結(jié)果，制定化療方案。其中8例患者采取TCH方案，18例患者采取TEC方案，14例患者采取 CE→T方案。TCH方案：第1天多西他賽75 mg/m2靜脈滴注，卡鉑按照濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)=6計(jì)算靜脈滴注；21 d為1個(gè)周期，共6個(gè)周期。第1周曲妥珠單抗4 mg/kg靜脈滴注，第2周起2 mg/kg，共17 周；第18周起，每3 周6 mg/kg，共12 個(gè)月。TEC方案：第1天，表阿霉素75 mg/m2靜脈滴注，多西他賽75 mg/m2靜脈滴注，環(huán)磷酰胺600 mg/m2靜脈滴注；21 d為1個(gè)周期，共6個(gè)周期。CE→T方案：第1天，環(huán)磷酰胺600 mg/m2靜脈滴注，表柔比星75 mg/m2靜脈滴注；21 d為1個(gè)周期，共4個(gè)周期。第1天序貫多西他賽75 mg/m2靜脈滴注，21 d為1個(gè)周期，共4個(gè)周期。2例采用CE→T方案患者，因化療3周期后腫塊無(wú)變化終止化療，其余患者均完成原定方案。

輔助化療后手術(shù)。術(shù)中取乳腺癌組織，并取距癌塊邊緣>5 cm癌旁組織。另選取同期10例有手術(shù)指征的纖維腺瘤患者作為對(duì)照，對(duì)照組年齡20～40歲，平均29.45歲。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 試劑 CD133、CDK8一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，二抗及SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。蛋白質(zhì)印跡法所用蛋白提取試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。

1.2.3 免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋，以4 μm厚連續(xù)切片、烤干，然后于二甲苯溶液及等級(jí)濃度梯度的乙醇溶液中脫蠟至水洗。免疫組化采用SP法，DAB顯色。所有試劑染色步驟按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。CDK8以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性， CD133以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每例標(biāo)本隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×200倍)，采用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定 使用核蛋白和漿蛋白抽提試劑盒提取組織蛋白。測(cè)定蛋白濃度后，取40 μg總蛋白用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗后4 ℃過(guò)夜。次日用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行顯色。凝膠成像系統(tǒng)拍照，條帶用 Image J軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照蛋白積分吸光度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料是t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新輔助化療前后患者臨床病理資料比較

共40例入組，年齡30～54歲，平均48.34歲，患者新輔助化療前后臨床病理資料對(duì)比見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，TNM分期、腫瘤直徑大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 新輔助化療前后患者臨床與病理資料比較[例 (%)]

注：n=40

2.2 CDK8和 CD133免疫組化表達(dá)

CDK8在新輔助化療前乳腺癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在新輔助化療后的乳腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，染色細(xì)胞數(shù)量減少；CDK8在纖維腺瘤及癌旁正常乳腺組織中幾乎不表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 CDK8免疫組化(SP ×200)1A、1B、1D取自62歲女性原發(fā)性乳腺癌患者，1A新輔助化療前，CDK8呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞核大量棕黃色顆粒；1B：新輔助化療后，CDK8表達(dá)減少；1D：癌旁正常乳腺組織，CDK8表達(dá)陰性；1C：取自25歲纖維腺瘤女性患者，CDK8表達(dá)陰性

CD133在新輔助化療前乳腺癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在新輔助化療后的乳腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，染色細(xì)胞數(shù)量減少；CD133在纖維腺瘤及癌旁正常乳腺組織中幾乎不表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 CD133免疫組化(SP ×200)2A、2B、2D取自56歲女性患者，2A：新輔助化療前，CD133呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)大量棕黃色顆粒；2B：新輔助化療后，CD133表達(dá)減少；2D為癌旁正常乳腺組織，CD133呈弱陽(yáng)性表達(dá)；2C：取自25歲纖維腺瘤女性患者，CD133呈陰性表達(dá)

2.3 CDK8和CD133的蛋白質(zhì)印跡法

CDK8在新輔助化療前乳腺癌組織中呈高表達(dá)，新輔助化療后表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且癌旁正常乳腺組織及纖維腺瘤組織中CDK8表達(dá)量均低于新輔助化療前乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖3，圖4。

CD133在新輔助化療前乳腺癌組織中高表達(dá)，新輔助化療后CD133表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且癌旁正常乳腺組織及纖維腺瘤組織中CD133表達(dá)量均低于化療前乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖3，圖4。

圖3 CDK8和CD133在乳腺癌新輔助化療前、乳腺癌新輔助化療后、乳腺纖維腺瘤及癌旁組織中的表達(dá)A為纖維腺瘤組織；B為癌旁正常乳腺組織；C為新輔助化療前乳腺癌組織；D為新輔助化療后乳腺癌組織

圖4 CD133和CDK8在乳腺癌新輔助化療前、乳腺癌新輔助化療后、乳腺纖維腺瘤及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)*為與新輔助化療前乳腺癌組織表達(dá)量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

3 討論

乳腺癌是女性癌癥死亡的第二大病因[9]。乳腺癌屬于化療敏感性腫瘤，但乳腺癌對(duì)化療無(wú)效的現(xiàn)象也很普遍。因此尋找新輔助化療療效預(yù)測(cè)因子至關(guān)重要。乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物CDK8與CD133目前在細(xì)胞和動(dòng)物方面的研究較多[5-6]。CDK8在黑素瘤，乳腺癌，前列腺癌和胰腺癌中高表達(dá)[7-9]。Crown[10]研究發(fā)現(xiàn)，CDK8在乳腺癌組織中上調(diào)，與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)。Xu等[11]研究189例人乳腺癌組織發(fā)現(xiàn)，CDK8表達(dá)水平與原發(fā)腫瘤狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。抑制CDK8能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[12]。此外，CDK8可預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者激素治療的療效[13-14]。CD133因子在乳腺癌新輔助化療方面研究較少。CD133多表達(dá)于較大腫塊、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等腫瘤進(jìn)展階段，提示CD133可能與腫瘤的侵襲性有關(guān)[15-17]。Xia等[18]發(fā)現(xiàn)，CD133是影響浸潤(rùn)性乳腺癌預(yù)后的一個(gè)潛在因素，可能是乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物[8]。但其作為干細(xì)胞標(biāo)志物可嘗試納入乳腺癌臨床研究中，明確其與新輔助化療療效的相關(guān)性，研究其能否作為療效預(yù)測(cè)因子。

本研究將腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CDK8和CD133同時(shí)納入研究，結(jié)果提示：患者新輔助化療前后腫瘤TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。免疫組化及蛋白質(zhì)印跡法提示：CDK8、CD133在新輔助化療前乳腺癌組織高表達(dá)，新輔助化療后CDK8表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且癌旁正常乳腺組織及纖維腺瘤組織中的CDK8和CD133表達(dá)量均低于新輔助化療前乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。新輔助化療前后，CDK8和CD133表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移變化趨勢(shì)一致，提示新輔助化療前后兩因子變化一致，且與療效變化一致。

綜上所述，CDK8與CD133可作為新輔助化療療效預(yù)測(cè)因子。但本研究樣本量不大，我們將進(jìn)一步加大樣本量研究。