錢金林，李青，劉華，金雷，曹磊，蘇紅丹，盧根福，王登山

宮頸癌發(fā)病率在女性生殖器官惡性腫瘤中占首位。近年來包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率和死亡率逐年增高，嚴(yán)重威脅女性健康，且日漸低齡化的發(fā)病趨勢更令人擔(dān)憂。國際癌癥小組多中心研究共識認(rèn)為，宮頸感染高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是女性宮頸癌和癌前病變發(fā)生的主要致病因素[1]。因此，HPV DNA分型檢測篩查早期宮頸癌及癌前病變具有重要意義。人乳頭瘤病毒L1(human papilloma virus L1， HPV L1)殼蛋白的表達(dá)可反映HPV病毒感染的不同階段，從而對宮頸病變的可能發(fā)展趨勢進(jìn)行預(yù)測[2]。本研究通過檢測高危HPV陽性患者HPV L1殼蛋白的表達(dá)，探討其在HPV單型感染和多重感染中的表達(dá)異同及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2017年6月，上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院婦科門診高危HPV陽性且因細(xì)胞學(xué)檢測陽性而取病理活檢的250例患者作為研究對象，并檢測HPV L1殼蛋白。患者年齡17～65歲，中位年齡32歲。入選本研究的受試者均事先簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)備案。

1.2 檢測方法

1.2.1 HPV DNA分型檢測 采用PCR-反向點(diǎn)雜交檢測23種HPV基因亞型，步驟包括HPV DNA擴(kuò)增、雜交、洗膜、顯色及結(jié)果判讀，具體操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。HPV DNA分型檢測試劑盒及相關(guān)輔助試劑均購自亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司。

1.2.2 HPV L1殼蛋白檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)法聯(lián)合非同位素標(biāo)記核酸分子雜交技術(shù)。HPV L1殼蛋白賽泰(細(xì)胞/組織人乳頭瘤病毒)(broad spectrum HPV L1)試劑盒購自美國愛迪旺斯醫(yī)療科技有限公司。

1.3 結(jié)果判定方法

1.3.1 HPV DNA分型 HPV DNA分型檢測包括18種高危亞型(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83)及5種低危亞型(HPV 6、11、42、43、81)，根據(jù)說明書提供的陽性檢測值判讀哪種類型HPV感染為陽性。

1.3.2 HPV L1殼蛋白檢測 HPV L1殼蛋白定位于細(xì)胞核，只要有一個鱗狀上皮細(xì)胞核被紅染即診斷為HPV L1殼蛋白陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間多個率的比較用R×C列聯(lián)表的χ2檢驗(yàn)及Fisher’s精確概率檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染亞型分布及相應(yīng)HPV L1殼蛋白表達(dá)

HPV L1殼蛋白陽性250例HPV感染患者中，單型感染199例，多重感染51例。HPV感染的各高危亞型中，檢測到13種高危型HPV亞型，其中感染頻度前6位依次為HPV52、16、58、33、31、18。HPV L1在各單一亞型HPV感染間的陽性表達(dá)率雖有不同，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 199例單型感染中HPV亞型分布及HPV L1殼蛋白的陽性數(shù)及陽性率

2.2 HPV L1殼蛋白在HPV單型感染和多重感染中的表達(dá)

多重感染中以兩種亞型混合最為常見，占86.3%(44/51)，其中HPV52和HPV58的混合感染最多見。HPV L1殼蛋白在單型與多重感染的陽性率分別為29.7%(59/199)和21.6%(11/51)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 宮頸不同病變中HPV L1殼蛋白表達(dá)及HPV單型和多重感染的分布

250例患者中正常或?qū)m頸炎患者185例(正?；?qū)m頸炎組)，低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)患者53例(LSIL組)，高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)患者9例(HSIL組)及宮頸癌組中的陽性率分別為21.6%、52.8%、22.2%、0，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HPV感染中，隨著宮頸病變級別的上升，HPV單型感染的陽性率逐漸降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而HPV多重感染的陽性率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同級別宮頸病變中HPV感染率及HPV L1殼蛋白的陽性率[例(%)]

2.4 HPV L1殼蛋白在不同年齡患者的表達(dá)

HPV L1殼蛋白在≤35歲、36～49歲、≥50歲3組中陽性率分別為25.5%(36/141)、27.3%(23/84)、44.0%(11/25)，3組間陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

HPV是迄今已被肯定的DNA腫瘤病毒之一，其感染與多種疾病密切相關(guān)。目前已知HPV分為高危型和低危型，其中高危型HPV感染與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)生密切相關(guān)。分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示，>90%宮頸癌伴有高危型HPV感染[3]。

HPV型別分布存在地區(qū)差異，在亞洲國家以52型和58型感染更常見。其中，上海42.5%宮頸癌中存在HPV 52、58型感染[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV陽性的患者中以52型感染最多見，其次是16型和58型。多重感染中以兩種亞型混合感染常見，其中HPV52和HPV58兩型混合感染最多見，占86.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。宮頸HPV單型感染和多重感染與宮頸病變的關(guān)系目前尚有爭議[6-7]。劉宗花等[8]研究顯示，高危型HPV多重感染可增加宮頸上皮內(nèi)病變風(fēng)險(xiǎn)，但與宮頸癌的發(fā)生無明確相關(guān)性。陶萍萍等[4]研究結(jié)果提示，除宮頸鱗癌外，HPV多重感染的比例隨著宮頸病變級別上升而升高。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV多重感染與宮頸病變程度密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了多重感染比單型感染易增加宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)。

HPV L1殼蛋白是HPV病毒主要的衣殼蛋白，作為外來抗原類物質(zhì)，是免疫反應(yīng)攻擊病毒和病毒感染細(xì)胞的主要靶位，與T細(xì)胞及Ⅰ/Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物形成免疫復(fù)合物，激活機(jī)體免疫反應(yīng)從而清除病毒，因此宮頸病變往往有自愈傾向[9]。但當(dāng)HPV DNA與宿主染色體發(fā)生整合后，HPV L1殼蛋白表達(dá)逐漸消失，不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使病變細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，最終引發(fā)宮頸病變和(或)病變進(jìn)展[10]。檢測HPV L1殼蛋白能有效評估宮頸癌及癌前病變進(jìn)展情況。HPV L1殼蛋白的表達(dá)與高危型HPV陽性的輕或中度細(xì)胞增生異形的消退密切相關(guān)[11]。HSIL和宮頸癌患者的HPV L1殼蛋白陽性表達(dá)率顯著低于LSIL和健康者[12]。隨著宮頸病變級別升高，HPV L1殼蛋白陽性表達(dá)率呈下降趨勢[13]。本研究中，我們分析了HPV L1殼蛋白在不同宮頸病變組織學(xué)類型中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從LISL、HISL到宮頸癌，HPV L1殼蛋白陽性表達(dá)率呈明顯下降趨勢，進(jìn)一步表明HPV L1殼蛋白的表達(dá)與宮頸病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，HISL且HPV L1殼蛋白表達(dá)陰性的宮頸病變患者進(jìn)展為宮頸癌可能性大，必須提高警惕，及時發(fā)現(xiàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，HPV 16和HPV 18型感染較其他高危型HPV感染進(jìn)展為宮頸高度病變和浸潤癌的風(fēng)險(xiǎn)更高，提示HPV L1殼蛋白表達(dá)可能與HPV感染亞型有關(guān)。HPV 16和HPV 18型感染者HPV L1殼蛋白陽性表達(dá)率低于其他亞型，更不易表達(dá)HPV L1殼蛋白[13]。本研究顯示，在最常見感染的HPV亞型中，HPV L1殼蛋白陽性多見于HPV31、16、33、52型，這可能與樣本例數(shù)較少有一定關(guān)系，尚需積累樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)于宮頸HPV單型感染和多重感染與HPV L1殼蛋白之間的關(guān)系，目前鮮見報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)HPV L1殼蛋白在HPV多重感染中的陽性率雖低于單型感染，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果一方面提示HPV多重感染中HPV L1陽性并不能保證所有的亞型都能使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[14]，另一方面也可能與本研究樣本量較小有一定關(guān)系。有關(guān)HPV L1殼蛋白表達(dá)和年齡的關(guān)系問題，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道存在一定分歧。本研究三段年齡組間HPV L1殼蛋白陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HPV L1殼蛋白表達(dá)與年齡無關(guān)。

綜上所述，HPV L1殼蛋白陽性會隨患者病變級別升高而下降，能夠預(yù)測疾病進(jìn)展；但在HPV多重感染中表達(dá)的臨床意義不顯著，可否將HPV L1殼蛋白檢測作為HPV多重感染的輔助指標(biāo)仍需進(jìn)一步研究。