蔣代富 朱曉英 肖雪

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

骨質(zhì)疏松是由于各種原因引起的骨量降低和骨結(jié)構(gòu)惡化，導(dǎo)致骨組織脆性增加、病理學(xué)骨折增多。在骨的微環(huán)境中成骨細(xì)胞帶來(lái)的骨形成及破骨細(xì)胞吸收在骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。既往研究表明：骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素過(guò)程，常涉及多種內(nèi)源性、外源性因素，均能實(shí)現(xiàn)骨組織的重構(gòu)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是成人骨重建中成骨前體細(xì)胞主要來(lái)源，能直接參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展。整合素(Integrin)α2能觸發(fā)及調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、分化過(guò)程，是細(xì)胞同周圍大分子基質(zhì)環(huán)境相互作用中的重要調(diào)節(jié)因子。本研究分析Integrin α2在老齡骨質(zhì)疏松BMSC成骨分化的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 采用西京醫(yī)院自愿捐獻(xiàn)者的骨髓，購(gòu)買Millipore生產(chǎn)的助轉(zhuǎn)染劑、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，Invitrogen公司生產(chǎn)的G418、Pen-Strep，Coatar公司生產(chǎn)的24孔板、96孔板，Sigma公司生產(chǎn)的4%多聚甲醛、0.5%結(jié)晶紫、β-磷酸甘油鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)的α-MEM培養(yǎng)液、MEM-supplement100X、L-谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，瑞典PHARMACIA公司生產(chǎn)的Percoll分離液，HYCLONE公司生產(chǎn)的胎牛血清(FBS)，Roche公司生產(chǎn)的地塞米松、吲哚美辛，Tecknova公司生產(chǎn)的抗壞血酸，R&D公司生產(chǎn)的anti-Integrins α2，Santa Cruz公司生產(chǎn)的anti-β-actin、anti-osterix、anti-Runnx2，Cell Signaling公司生產(chǎn)的anti-磷酸化(p)、蛋白激酶B(AKT)、anti-AKT、anti-p-p38、anti-p38、anti-p-JNK、anti-JNK、anti-p-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、anti-ERK1/2。

1.1.2主要儀器及設(shè)備 購(gòu)買美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)的PCR儀，美國(guó)Therom Scientific公司生產(chǎn)的HEPA CLASS100細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的1300 SERIES A2超凈工作臺(tái)，Leica公司生產(chǎn)的Leica倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡，美國(guó)BD公司生產(chǎn)的CAN/CSRC流式細(xì)胞儀。

1.2方法

1.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC效率的檢測(cè) 將1×105個(gè)BMSCs接種在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)板上，以含有濃度為17%的FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃的孵育箱中過(guò)夜，其含5%CO2。接種第2天將10 ml新鮮α-MEM培養(yǎng)基更換過(guò)來(lái)，加入20 μl 50 mg/ml助轉(zhuǎn)染劑，分別按感染復(fù)數(shù)(MOI)=10、20、50、100將其和Intergrin α2一起加入對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在此過(guò)程中嚴(yán)格依據(jù)病毒滴度，搖勻后在37℃ 含5%CO2的孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)。1 d后將細(xì)胞上清去除，將等量α-MEM重新加入，在37℃ 含5%CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下對(duì)熒光進(jìn)行觀察。消化離心細(xì)胞后將其凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)基液氮中〔1〕。

1.2.2骨質(zhì)疏松患者BMSC中Intergrin α2轉(zhuǎn)染后高表達(dá)的檢測(cè)

1.2.2.1Intergrin α2的轉(zhuǎn)染高表達(dá)qPCR檢測(cè) Intergrin α2及內(nèi)參引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：12.5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ+1 μl PCR前引物+1 μl PCR后引物(終濃度為0.4 μmol/L)+2 μl cDNA模板(添加量、模板體積/總體積分別在100 ng、1/10以下)+8.5 μl無(wú)菌水=25 μl。反應(yīng)條件為：在95℃的溫度下進(jìn)行30 s的1個(gè)循環(huán)，在95℃、60℃的溫度下分別進(jìn)行5 s、30 s 40個(gè)循環(huán)。采用Realtime PCR分析未轉(zhuǎn)染BMSCs及轉(zhuǎn)染后BMSCs Intergrin α2 mRNA水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2.2Intergrin α2的轉(zhuǎn)染高表達(dá)Western印跡檢測(cè) 制備蛋白樣品，提取細(xì)胞總蛋白，然后測(cè)定蛋白含量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)模，免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光、顯影及定影反應(yīng)，分析凝膠圖像〔3〕。

1.2.2.3Intergrin α2轉(zhuǎn)染在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)熒光檢測(cè) 對(duì)Intergrin α2表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞爬片免疫熒光檢測(cè)，在帶有12 mm細(xì)胞爬片的24孔板中接種轉(zhuǎn)染后骨質(zhì)疏松BMSCs、野生型骨質(zhì)疏松BMSCs，每孔1×104，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。用普通α-MEM培養(yǎng)基，定期對(duì)相應(yīng)的培養(yǎng)液進(jìn)行更換，每2～3 d 1次，培養(yǎng)間隔為5 d，5 d后觀察熒光，即將培養(yǎng)液吸去，PBS清洗，將3.7%多聚甲醛加入對(duì)細(xì)胞進(jìn)行20 min的固定，PBS洗滌2次，每次5 min，將少量封片劑滴到載玻片上，在小心覆蓋細(xì)胞爬片，熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞染色情況進(jìn)行觀察并照相〔4〕。

1.2.3骨質(zhì)疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表達(dá)的影響

1.2.3.1MTT分析 在96孔板中接種鋪滿轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在37℃、5%CO2孵育箱中孵育，第2、4、6、8天分別將5個(gè)復(fù)孔取出來(lái)，將20 μl MTT溶液(0.5%MTT)加入到每孔中，培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)培養(yǎng)液小心吸去，將150 μl DMSO加入到每孔中，在搖床上放置，進(jìn)行10 min的低速振蕩，充分溶解結(jié)晶物。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀在OD 490 nm處對(duì)各孔吸光值進(jìn)行測(cè)量〔5〕。

1.2.3.2成骨分化與檢測(cè) 在6孔板中接種轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，3×103/孔，將2 ml/孔干細(xì)胞完全培養(yǎng)液加入到每孔中。常規(guī)培養(yǎng)達(dá)到70%融合，每孔加入2 ml成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。定期換液，每3 d 1次，進(jìn)行2～3 w誘導(dǎo)。1 w后對(duì)成骨特異性基因Osterix、RUNX2表達(dá)情況進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。1 w、2 w、3 w后分別進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色，2 w、3 w后形成鈣結(jié)節(jié)，進(jìn)行茜素紅染色〔6〕。

1.2.4骨質(zhì)疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表達(dá)影響的作用機(jī)制 成骨誘導(dǎo)分化后即刻、30 min、1 h、6 h分別對(duì)ERK/AKT/JNK/P38活性水平進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。骨質(zhì)疏松患者BMSC Intergrin α2高表達(dá)促進(jìn)成骨分化受到PD98059的影響，分別以0、25、50 μmol/L濃度對(duì)未轉(zhuǎn)染Intergrin α2、轉(zhuǎn)染Intergrin α2的骨質(zhì)疏松患者BMSC進(jìn)行干預(yù)，對(duì)其ALP染色、茜素紅染色受到成骨分化特異基因RUNX2的影響進(jìn)行觀察〔7～10〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC效率的檢測(cè) BMSCs對(duì)Intergrin α2進(jìn)行轉(zhuǎn)染3 d后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)有GFP表達(dá)，MOI=10,20,50,100時(shí)視野中分別有零星熒光、少許熒光、顯著較多的熒光、最多的熒光，GFP陽(yáng)性率分別為(8.3±5.3)%、(28.0±4.9)%、(34.0±6.3)%、(42.0±5.0)%。

2.2BMSC轉(zhuǎn)染后Intergrin α2高表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1Intergrin α2轉(zhuǎn)染后成功高表達(dá)目的基因qPCR檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后BMSC Intergrin α2表達(dá)顯著高于野生型BMSC(1.78±0.51 vs 0.25±0.08，P<0.05)。

2.2.2熒光檢測(cè)Intergrin α2蛋白高表達(dá)轉(zhuǎn)染后 Intergrin α2蛋白表達(dá)為43.19±4.72，轉(zhuǎn)染前為14.75±3.15；轉(zhuǎn)染前熒光強(qiáng)度為3.51±0.69，轉(zhuǎn)染后為7.35±0.73，在慢病毒轉(zhuǎn)染后顯著提升，免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。

2.3骨質(zhì)疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表達(dá)的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)4 d后，細(xì)胞向增殖期進(jìn)入，具有較大的生長(zhǎng)曲線斜度，說(shuō)明細(xì)胞增殖速度在轉(zhuǎn)染后明顯加快，骨質(zhì)疏松患者BMSC Intergrin α2高表達(dá)能夠?yàn)榧?xì)胞增殖提供良好的前提條件。Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)比轉(zhuǎn)染后野生型Osterix、RUNX2表達(dá)顯著提升，ALP活性在第3天、1 w、2 w分別增加(43.65±4.31)、(58.01±4.52)、(60.40±4.81)。對(duì)Intergrin α2進(jìn)行轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松BMSC礦化能力的增強(qiáng)，2 w、3 w分別增加(40.80±4.23)、(54.80±5.77)。骨質(zhì)疏松患者BMSC Intergrin α2高表達(dá)能夠?yàn)槌晒欠只峁┝己玫那疤釛l件。

2.4骨質(zhì)疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表達(dá)影響的作用機(jī)制 成骨誘導(dǎo)后30 min，轉(zhuǎn)染后ERK快速活化，1 h時(shí)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(3.29±0.53 vs 6.49±1.05，P<0.05)，但是二者的AKT/JNK/P38之間的差異不顯著〔(0.59±0.11)% vs (0.60±0.13)%，P>0.05〕。Intergrin α2將ERK1/2通路活化，從而為細(xì)胞增殖、分化提供了良好的前提條件。PD98059能夠抑制活化ERK、轉(zhuǎn)染后RUNX2，進(jìn)而抑制茜素紅染色所體現(xiàn)的成骨分化、ALP活性。

3 討 論

隨著患者年齡的增長(zhǎng)，人體多種重要器官由于干細(xì)胞維持組織平衡能力下降，從而引起衰老相關(guān)疾病表現(xiàn)，亦包括骨組織，衰老能引起骨組織代謝與功能異常。經(jīng)典理論認(rèn)為，骨質(zhì)疏松的發(fā)病是由維持骨發(fā)育動(dòng)態(tài)平衡被打破引起。對(duì)于正常人而言，骨組織內(nèi)含有成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞兩類不同的成熟的骨細(xì)胞，能調(diào)節(jié)骨替代機(jī)制，從而調(diào)節(jié)骨替代機(jī)制。既往研究表明：骨重塑包括一系列細(xì)胞事件，始于募集破骨細(xì)胞前體，并融合形成成熟破骨細(xì)胞，并在骨表面發(fā)生遷移，從而吸收一定量的骨、創(chuàng)建一個(gè)吸收陷窩。骨吸收后能在同一解剖位置募集形成成骨細(xì)胞，從而引起礦化與薄層骨形成。BMSCs存在于成熟機(jī)體骨髓間質(zhì)中，具有自我復(fù)制能力與多向分化潛能，由于其能向多種中胚層、跨胚層向內(nèi)、外胚層來(lái)源的組織分化能力，如：骨、軟骨、脂肪及纖維組織等多種間充質(zhì)組織，被稱為骨髓基質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞。骨髓基質(zhì)組織由骨髓中一類異質(zhì)細(xì)胞群組成，共同構(gòu)成、支持造血微環(huán)境。本研究結(jié)果表明Intergrin α2/ERK/Runx2信號(hào)通路參與了老齡骨質(zhì)疏松發(fā)病，這為該病的預(yù)防與治療提供了新的分子機(jī)制。