朱小堅 朱正明

(南昌大學江西醫(yī)學院，南昌 330006)

腹膜由覆蓋于腹、盆腔壁的壁腹膜與器官表面的臟腹膜構成，其間質包含大量間皮細胞、免疫細胞、成纖維細胞及少量結締組織和血管淋巴組織，是全身面積最大、結構最復雜的漿膜。腹膜轉移是影響胃癌(Gastric cancer,GC)治療方式和預后的重要因素。在中國，腹膜轉移占GC轉移的53%～60%，超過肝轉移(40%)和其他轉移(3%～7%)；T3/T4期10%～20%已存在腹膜微小轉移灶；發(fā)生腹膜轉移5年生存率僅為2%，中位生存期只有3～6個月[1]。腹膜轉移是一系列多步驟進行性發(fā)展過程，包括癌細胞脫離原發(fā)腫瘤；在腹腔中游離存活；附著于遠處腹膜；侵入腹膜下組織并通過新生血管增殖等。腹腔微環(huán)境中的多種細胞成分以及相關細胞活性物質為GC腹膜擴散、種植提供了適宜的土壤。本文就腹腔微環(huán)境中參與GC腹膜轉移的主要細胞成分進行綜述。

1 人腹膜間皮細胞(Human peritoneal mesothelial cells，HPMCs)

1.1腹膜間質中含有豐富的HPMCs，大量研究表明GC腹膜轉移與HPMCs密切相關。顯微鏡下HPMCs呈星狀，匯合后呈多邊形，直徑約為9～15 μm，表面有豐富的微絨毛。HPMCs廣義上被歸類為上皮細胞，具有上皮細胞的許多特征，例如頂/基極性、基膜黏附、連接復合物。其雙重表型特征影響細胞功能，決定它們如何對環(huán)境變化做出反應。HPMCs正常形態(tài)為鵝卵石樣的單層細胞緊密排列在腹膜表面，是阻止微生物、腫瘤細胞侵入的第一道防線[2]。HPMCs在受到外來刺激下細胞骨架發(fā)生重構，呈紡錘形，細胞形態(tài)學的特征為GC腹膜轉移提供了可行性。隨著我們對HPMCs生理學知識的深度了解，發(fā)現(xiàn)HPMCs作為一種動態(tài)細胞兼具其他重要的生理功能。例如HPMCs通過分泌廣泛的細胞因子、生長因子和細胞外基質蛋白參與炎癥和組織修復[3]；表達Ⅱ類主要組織相容性復合體分子，通過抗原呈遞方式調節(jié)免疫應答[4]；在受到外來刺激完整性遭到破壞的情況下，通過增強腫瘤細胞黏附、增殖，促進結直腸癌與卵巢癌等惡性腫瘤腹膜轉移[5,6]。

1.2侵襲轉移是腫瘤細胞在一系列多步驟發(fā)展過程中由自身和局部腫瘤微環(huán)境雙向誘導作用所獲得的一種能力。Paget等[7]提出“種子和土壤”理論，即轉移只發(fā)生在有利于腫瘤細胞生存和生長的環(huán)境中。首先，細胞因E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、膜聯(lián)蛋白1(Annexin 1)等細胞間黏附分子的表達下降[8,9]以及上調S100鈣結合蛋白A4(S100A4)表達，通過改變細胞骨架動力學影響癌細胞運動性[10]，從而促進癌細胞自動脫離進入腹腔，成為腹腔游離癌細胞(Intraperitone free cancer cells，IFCCs)。之后IFCCs克服缺氧微環(huán)境得到生存，并在重力、胃腸道蠕動及膈肌運動等產(chǎn)生的壓力幫助下擴散并最終種植于遠處HPMCs的表面。然而，即使IFCCs成功附著于腹膜后，大多數(shù)IFCCs也會因腹膜-血屏障而死亡，只有少數(shù)IFCCs可通過穿透作用進入內膜間隙，隨后IFCCs在轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor，EGF)、基質金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinase，MMP)等作用下，誘導間皮細胞收縮，暴露出間皮下基底膜，誘導HPMCs凋亡。

1.3研究表明GC腹膜轉移與誘導HPMCs凋亡息息相關。IFCCs黏附于HPMCs后首先透過間皮屏障發(fā)生滲透，細胞間相互作用伴隨著異型細胞間通訊，其主要由細胞間隙中的質膜連接蛋白介導。Tang等[11]最新發(fā)現(xiàn)質膜連接蛋白(Connexin43,Cx43)的高表達充當GC細胞與HPMCs細胞間的信息交流橋梁，這有助于GC細胞黏附于HPMCs。IFCCs成功黏附于HPMCs后進入內膜間隙，誘導HPMCs凋亡，導致HPMCs表面損傷，研究表明創(chuàng)傷間皮表面往往是腫瘤細胞黏附的優(yōu)選位點。Na等[12]發(fā)現(xiàn)GC細胞MKN45的細胞上清液在與腹膜間皮細胞HMrSV5混合培養(yǎng)后，鏡下發(fā)現(xiàn)HMrSV5出現(xiàn)顯著凋亡形態(tài)學改變，如染色質固縮、核碎裂以及凋亡小體形成。這些數(shù)據(jù)表明MKN45上清液可以誘導HPMCs凋亡，且與凋亡相關蛋白(Bax，Bcl-2)的異常表達有關，這可能是腫瘤細胞黏附于間皮下組織的分子機制。另外在HMrSV5上清液中還發(fā)現(xiàn)轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達，其通過誘導HPMCs中膠原蛋白Ⅲ和纖連蛋白的表達，也相應增加了GCC黏附能力[13]。腫瘤細胞來源的TGF-β1作用于HPMCs，刺激誘導產(chǎn)生活化的aHPMCs，其有助于纖維化面積的繼續(xù)擴大[14]。最新研究發(fā)現(xiàn)，TGFβI作為TGF-β誘導HPMCs活化的一種細胞外基質蛋白，其表達可誘導HMrSV5細胞黏附并顯著增加其增殖遷移能力[15]。Miao等[16]也證實GCC分泌的TGF-β1以自分泌/旁分泌方式作用于HPMCs，促進了GC腹膜轉移的纖維化進程。這些數(shù)據(jù)表明TGF-β1通過作用于HPMCs，誘導腹膜纖維化，為胃癌的腹膜轉移創(chuàng)造了良好的微環(huán)境。另外近幾年研究熱點表明，腫瘤來源的外泌體通過引起HPMCs的損傷破壞間皮屏障并誘導間皮細胞凋亡及上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，還通過誘導間皮細胞黏附分子如纖連蛋白1(Fibronectin1,FN1)、層黏連蛋白γ1(Laminin subunit gamma1,LAMCγ1)表達增加等方式促進GC腹膜轉移。

1.4HPMCs的EMT過程是腫瘤侵襲轉移的一個中心環(huán)節(jié)。發(fā)生EMT后的HPMCs表面E-cadherin表達水平顯著降低，平滑肌肌動蛋白(α Smooth muscle actin,α-SMA)表達水平增加，導致HPMCs細胞骨架重組呈紡錘體形態(tài)。發(fā)生EMT后的HPMCs失去了原有上皮細胞的特征，分化成肌成纖維細胞，同時也獲得能夠產(chǎn)生細胞外基質的特征，這些改變導致腫瘤細胞穿越基底膜向鄰近組織游走的能力相應增強。其EMT過程主要由TGF-β誘導產(chǎn)生，最新發(fā)現(xiàn)結締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)和胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor，IGF-1)作為HPMCs的EMT發(fā)生新型有效激活劑，也可促進EMT的發(fā)生[17,18]。隨著對腹膜轉移分子機制的深入研究，在LncRNA、MicroRNA多個層面均可有效地控制或延緩HPMCs的EMT過程，從而抑制GC腹膜轉移。綜上，HPMCs的EMT發(fā)生在GC腹膜轉移進程中扮演著至關重要的角色，針對EMT的靶向治療有望更好地防治GC腹膜轉移。

2 腫瘤相關成纖維細胞

2.1腫瘤相關成纖維細胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)是腫瘤基質的重要組成部分。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，CAFs通過一系列功能(包括細胞外基質沉積、血管生成、化療多藥耐藥)在腫瘤-基質相互作用中發(fā)揮著不可或缺的作用。CAFs呈紡錘形狀，α-SMA和成纖維細胞活化蛋白的過表達是其表面主要的特異性標志物。CAFs主要來源于間充質干細胞、EMT化的HPMCs。此外也有研究表明骨髓來源的CAFs通過人基質細胞衍生因子(Stromal cell-derived faceor-1，SDF-1)/C-X-C趨化因子受體4型(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)系統(tǒng)遷移進入腹腔微環(huán)境中并增強腫瘤纖維化[19]。之后CAFs在腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的一系列生長因子、炎癥因子[TGF-β、胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor,IGF)-1、IL-4]的激活下分化增殖。有研究利用蛋白質組學生物技術發(fā)現(xiàn)膜蛋白Caveolin-1(Cav-1)作為激活CAFs的關鍵調節(jié)因子，介導CAFs的活化，從而促進GC纖維化[20]。同樣CAFs來源的Asporin通過CD44-Ras相關的C3肉毒底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac 1)途徑活化介導的旁分泌作用于CAFs也能促進GC細胞的侵襲遷移[21]。這些研究表明腫瘤微環(huán)境中提供的血小板衍生因子(Platelet derived growth factor，PDGF)與MMP等多種活性分子通過復雜的信號通路參與CAFs的活化。因此，針對CAFs纖維化的靶向治療也能有效控制GC腹膜轉移。

2.2激活后的CAFs可分泌大量信號分子并通過復雜信號通路作用于GC細胞，促進其侵襲轉移。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CAFs分泌的IL-6、IL-11、IL-22等因子也促進了GC的侵襲轉移進程。例如腫瘤微環(huán)境中CAFs分泌的IL-6通過JAK2/STAT3信號通路促進GC的EMT和轉移[22]；上調黏蛋白MUC1通過IL-11-STAT3/ERK信號傳導途徑促進GC進展[23]；分泌IL-22激活STAT3/ERK信號傳導途徑可促進GC侵襲[24]。另外，CAFs對MicroRNA的表觀遺傳學改變(DNA甲基化修飾)也可刺激GC腹膜轉移。例如，在GC中CAFs通過MiR-200b的表觀遺傳學改變參與癌旁細胞的進展和侵襲[25]；腫瘤基質CAFs中的MiR-106b通過靶向作用于PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromo-some ten)促進細胞遷移侵襲[26]；CAFs基質中的MiR-143通過TGF-β/SMAD信號通路正向調節(jié)Ⅲ型膠原蛋白的表達進而間接促進GC的纖維化進程[27]。目前，CAFs中MicroRNA信號通路的相關研究正成為胃腸腫瘤領域的熱點，因此對于CAFs中MicroRNA信號通路功能的研究有望成為GC腹膜轉移的治療新靶點。激活后的CAFs可分泌大量相關小分子蛋白(受體蛋白、配體蛋白、細胞外基質蛋白等)，介導CAFs與腫瘤細胞間的信息交流。CAFs分泌的一些細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)蛋白也在促進GC轉移中起重要作用，例如Lumican、POSTN等。Lumican在GC CAFs中高表達，其由CAFs分泌到GC的微環(huán)境中，通過激活整合素β1-FAK信號通路來促進GC細胞增殖、遷移和侵襲[28]。糖結合蛋白(Galectin，Gal)-1是一種在CAFs中過表達的碳水化合物結合蛋白，由CAFs分泌并通過上調整合素β1促進細胞增殖。POSTN是由CAFs分泌的一種ECM蛋白，并通過激活ERK途徑參與上皮細胞的黏附和遷移[29]。體外研究進一步證明，GC細胞與表達POSTN的CAFs共培養(yǎng)促進腫瘤形成[30]。因此，CAFs分泌的ECM蛋白為GC侵襲轉移提供了良好的微環(huán)境。此外，包括生長因子、趨化因子、膜蛋白在內的多種分子也在CAFs中高度表達，他們均可促進GC的發(fā)生發(fā)展。這些研究表明，CAFs作為基質細胞的重要組分可分泌許多分子進一步促進腫瘤發(fā)展。

2.3外泌體是一些包含功能性生物分子的小膜囊泡，大小30～200 nm不等。最近的研究表明，CAFs除自身直接參與GC轉移的纖維化過程外，CAFs來源的外泌體可能與腫瘤微環(huán)境的形成有關，如轉移性生態(tài)、血管生成。外泌體具有與其起源相關的特定組成，不僅可轉移膜成分，而且可轉移異型細胞之間的核酸，表明外泌體在細胞間通訊中發(fā)揮著復雜的作用。在Gu等[31]一項研究中，間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)在暴露于GC細胞來源的外泌體中培養(yǎng)后獲得了CAFs表型，并且MSCs向CAFs分化與TGF-β/Smad信號通路的活化相關，分化后的CAFs促使腫瘤微環(huán)境向有利于GC發(fā)生的方向發(fā)展。最近Miki等[32]也發(fā)現(xiàn)，通過將硬皮型GC細胞系(OCUM-12、NUGC-3)與CAFs來源的外泌體共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)源自CAFs且表達CD9+(外泌體表面標志物)的外泌體顯著刺激OCUM-12和NUGC-3細胞的侵襲和遷移，其分子機制可能與細胞外MMP活化、β1整合素的過表達有關。以上研究均表明CAFs來源的外泌體參與了腫瘤微環(huán)境的形成，直接或間接促進GC的增殖和侵襲，提示CAFs可作為GC治療的新靶點。

3 免疫細胞

3.1腫瘤相關巨噬細胞 慢性炎癥在惡性腫瘤的形成過程中起重要調節(jié)作用，腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)在這一過程中發(fā)揮關鍵作用。巨噬細胞分為兩種主要表型：M1和M2。M1型特征在于釋放炎性細胞因子、活性氮、氧中間體，具有殺傷病原體、腫瘤細胞活性。相反，M2型被諸如IL-4、IL-13和IL-10等抗炎分子、凋亡細胞和免疫復合物表達免疫抑制表型，其可緩解炎性反應，清除細胞碎片，促進血管生成和組織重構[33]。但至今在GC腹膜擴散患者中，大量TAMs主要表現(xiàn)M2型。TAMs主要通過CCL2-CCR2軸將血液中單核細胞募集于腫瘤細胞周圍，之后在腫瘤微環(huán)境中的生長因子、細胞因子作用下極化為M2型。Takahisa等[34]在研究GC腹膜擴散的過程中發(fā)現(xiàn)，GC細胞MKN45與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)時，M2型TAMs數(shù)量增多，M2相關信使RNA(IL-10、血管內皮生長因子A/C等)也都表達增加，最終導致腫瘤的加速生長，其具體的調控機制可能與激活EGFR信號通路有關。TAMs調節(jié)GC侵襲和轉移的方式也呈多樣化，例如通過作用于TGF-β與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)促進轉移；TAMs來源外泌體通過NF-κB途徑促進侵襲；TAMs遷徙抑制因子通過活化PI3K/Akt 抑制GC轉移。這些研究表明TAMs在GC腹膜轉移的過程中具有復雜的調節(jié)作用，其調節(jié)分子機制的闡明對于GC的靶向治療具有極其重要的意義。

血管、淋巴管生成是腫瘤轉移不可或缺的一步，TAMs被認為在腫瘤組織血管、淋巴管生成過程中起到了重要的支持作用。在Wu等[35]對TAMs數(shù)量與GC臨床特征的分析研究中發(fā)現(xiàn)，TAMs與漿膜浸潤、淋巴結轉移和TNM分期之間存在顯著相關性，提示TAMs累積可能與GC進展有關。進一步的研究發(fā)現(xiàn)TAMs數(shù)量與GC中的微血管密度和淋巴管密度有關，表明TAMs可能參與GC中的血管、淋巴管生成。腫瘤組織血管、淋巴管生成過程是腫瘤細胞與間質組分之間一系列相互作用的結果，特別是TAMs等免疫細胞的維持作用。據(jù)報道，缺氧環(huán)境在腫瘤血管的生成中發(fā)揮顯著作用。Shen等[36,37]通過對比缺氧與正常生理條件下TAMs對腫瘤細胞遷移能力及與腫瘤侵襲、轉移有關的基因[包括去整合素金屬蛋白酶(A disintegrin and metallopro-tease，ADAM)8/9、MMP9、金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)3等]表達的影響，發(fā)現(xiàn)ADAM8/9高表達，MMP9、TIMP3低表達。另外在缺氧腫瘤微環(huán)境中IL-10、IL-11、IL-18在CD14+TAMs中表達也各不同。這些數(shù)據(jù)提示我們TAMs、缺氧環(huán)境在體外調節(jié)GC細胞侵襲時起著不可或缺的作用。有研究結果表明，在微環(huán)境中腫瘤細胞與TAMs之間的相互作用通過轉錄因子NF-κB的激活調節(jié)VEGF和VEGF-C表達進而影響血管、淋巴管生成的過程。這提示我們TAMs參與GC血管、淋巴管生成的過程是治療GC腹膜轉移的有效新靶點。Shen等[36,37]后續(xù)實驗也證實了這一觀點，發(fā)現(xiàn)Vasohibin-1、Vasohibin-2在GC細胞和TAMs中顯著低表達，其表達水平受TAMs和缺氧的調節(jié)，且在每個胃細胞系中表達有差異。Vasohibin-1、Vasohibin-2不僅可作為內皮細胞產(chǎn)生的內源性血管生成抑制劑，還能作為其他細胞分泌的外源因子在血管生成調節(jié)中發(fā)揮重要作用，因此Vasohibin-1、Vasohibin-2作為血管生成抑制劑可能是治療GC的潛在靶點[38]。

最近在巨噬細胞介導GC的遷移和侵襲的研究中發(fā)現(xiàn)凝血因子也能刺激巨噬細胞向M2表型TAMs分化。Ma等[39]發(fā)現(xiàn)M2表型TAMs在凝血因子VIIa、凝血因子XIIa的激活下分泌大量與腫瘤轉移相關的細胞因子IL-4、IL-10、TGF-β、TNF-α，進而誘導GC細胞的遷移和侵襲。在探尋GC細胞遷移和侵襲的分子機制中發(fā)現(xiàn)其可能與介導VEGF/MMP-9的表達有關。此外，包括細胞因子、趨化因子、細胞外基質蛋白在內的多種分子也在TAMs中高度表達，并刺激GC侵襲。這些包括細胞因子IL-10、IL-11、IL-18、長鏈蛋白P115和細胞外基質蛋白骨橋素(Osteopontin,OPN)。這些研究表明，活化的TAMs可進一步表達促進GC發(fā)展的分子，為GC的腹膜轉移提供有利的腹腔微環(huán)境。

3.2調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Tregs) Tregs是一類具有免疫調節(jié)功能的T淋巴細胞，可抑制效應T細胞活化增殖而導致免疫功能紊亂。近年來，腫瘤內Tregs特別是其亞型被認為在腫瘤免疫逃逸中起關鍵作用，Tregs與GC預后不良息息相關。FoxP3+Tregs是最受關注的Tregs亞型，在腫瘤微環(huán)境中具有復雜的調節(jié)作用。在Yuan等[40]的一項研究中，F(xiàn)oxP3+Tregs在胃腫瘤中高表達，分析發(fā)現(xiàn)高密度的FoxP3+Tregs與腫瘤TNM分期有關。腫瘤浸潤性Tregs中FoxP3的表達增加可以通過環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase,COX)2/聚乙二醇軸在腫瘤微環(huán)境中介導免疫抑制，較高水平的FoxP3+Treg細胞能夠抑制自體CD4+CD25-T細胞的增殖。因此這給我們提供了一個治療GC的新思路，通過調節(jié)Tregs活性來減弱腫瘤免疫逃逸作用。有趣的是，Tregs的調節(jié)作用不僅與細胞亞型有關，還和細胞間距有聯(lián)系。Feichtenbeiner等[41]首次研究CD8+與FoxP3+腫瘤浸潤T淋巴細胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)的同時空間分布模式及其對GC預后影響中發(fā)現(xiàn)，TILs影響預后的關鍵取決于細胞間距。FoxP3+TILs必須位于與CD8+TILs細胞30～110 μm之間的距離內，才會對預后產(chǎn)生積極影響。Kim等[42]也證實了腫瘤內CD8+和FoxP3+TILs高密度表達與預后良好相關，提示這兩個亞型的TILs協(xié)同作用可作為GC的獨立預后因素。新發(fā)現(xiàn)的CD45RA-CCR7-效應/記憶表型Tregs亞型構成了大多數(shù)腫瘤浸潤性Tregs。GC中該亞型表達豐富，且與疾病進展和術后患者的生存率呈負相關。其抑制免疫反應的分子機制可能是腫瘤來源的TNF-α通過誘導信號轉導和轉錄激活因子STAT3磷酸化，有效誘導CD45RA-CCR7-Treg亞型并抑制這些細胞上的人類白細胞的DR抗原表達。反過來，CD45RA-CCR7-Treg亞型通過IL-10分泌和細胞間接觸而抑制CD8+T細胞抗腫瘤反應，進而有助于腫瘤逃脫免疫抑制[43]?？傊甌regs的亞型種類、數(shù)量、分布都與GC侵襲和轉移過程密切相關，通過調節(jié)Tregs的聯(lián)合免疫治療方式可能會改善GC治療效果。

4 結語與展望

腹腔微環(huán)境含有豐富的細胞成分并處于大量的活性分子包繞之中，隨著腫瘤細胞從原位脫離進入腹腔形成IFCCs并在腹腔種植，腫瘤微環(huán)境就向著有利于GC進展的方向發(fā)展。由于腹腔內的多種細胞成分及其表達的相關活性物質提供的適宜土壤，從而促進了GC的腹膜轉移過程。因此，從腹腔微環(huán)境中的這些細胞成分與GC細胞的相互作用過程中能更好地了解GC腹膜擴散形成的分子機制，有助于開發(fā)針對每一步GC腹膜轉移的新干預措施和分子靶向治療，使GC靶向治療邁上一個新臺階。