廖傳文 ，李潔蘭 ，殷俊翔 ，胡淑琴 ，饒雪峰

(1.江西省人民醫(yī)院普外科，南昌 330006；2.江西省吉水縣人民醫(yī)院，吉水 331600)

中藥在抗腫瘤方面扮演著非常重要的作用[1]，槐耳提取物在中國有1600年的使用歷史[2]，研究表明槐耳提取物在體外可抑制多種腫瘤細胞活性及增殖作用[3]。自噬是一個保守的依賴溶酶體的降解途徑，可降解長壽命蛋白質(zhì)、細胞器和部分細胞質(zhì)，并已被證明參與包括能量代謝、細胞器周轉(zhuǎn)、生長調(diào)節(jié)和衰老等生理病理過程[4，5]。近年來研究表明，自噬在腫瘤細胞生長、分化和抵抗藥物治療等方面扮演重要角色[6]?；倍欠衲芡ㄟ^影響胃癌細胞自噬進而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，尚鮮有報道。本研究以胃癌細胞NCI-N87為研究對象，探討槐耳清膏對NCI-N87細胞自噬影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 槐耳清膏 (江蘇啟東蓋天力公司)，DMEM溶解后，0.22um濾膜過濾，加入10%PBS，使其終濃度分別為 4、8、16、32mg/ml。 胃癌細胞株NCI-N87購于中國生命科學(xué)院上海細胞庫。啶橙購 自 Sigma 公 司 ，Beclin 1、PTEN、LC3-II 和GAPDH抗體購于Santa cruz公司；TRIzol試劑購于invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；Real-Time PCR試劑盒為fermentas公司產(chǎn)品；Real-Time PCR擴增儀為美國ABI公司產(chǎn)品；流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)印槽為Bio.Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NCI-N87細胞株常規(guī)在含10%胎牛血清的0.1%DMSO培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞長滿至80%融合度時，以1：3比例進行傳代。使活細胞數(shù)＞95%，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞抑制率 將對數(shù)生長期NCI-N87細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞接種數(shù)目為2000個，同時每孔加入培養(yǎng)液100μl，另設(shè)不加細胞的培養(yǎng)液為本底，24h后實驗組分別加入槐耳清膏10μl，使其最終濃度分別為4、8、16、32mg/ml。空白對照組為未加藥物的細胞，加入等量培養(yǎng)液。每個濃度設(shè)有6個復(fù)孔，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h，每日相同時間點將不同濃度組的細胞放置于倒置顯微鏡下觀察其細胞形態(tài)改變，并于時間點向各個孔培養(yǎng)液中分別加入CCK-8試劑各10μl，然后于5%CO2、37℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，使用酶標儀測試吸光度，測定標準為490nm的的吸光度波長，記錄所有孔的吸光度（OD）的數(shù)值，計算細胞抑制率(%)。細胞抑制率 (%)=[1-(實驗組OD值一空白組OD值)/(對照組OD值一空白組OD值)]×100%。

1.2.3 AnnexinV/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期的NCI-N87細胞制成懸液，按5×103個/ml接種于6孔板中，共設(shè)6組，每組設(shè)3個復(fù)孔，向各實驗組分別加入含濃度為4、8、16、32mg/ml槐耳培養(yǎng)液，處理24h。對照組加入含0.1%DMSO培養(yǎng)基。檢測前用PBS洗滌細胞2次，按照說明書進行以下操作：每管加入5μl的AnnexinV和PI復(fù)合染液和500μl結(jié)合緩沖液，避光染色20min后，進行流式細胞儀檢測，分析槐耳處理后的細胞凋亡百分比變化。

1.2.4 細胞自噬小體的定量檢測 不同濃度槐耳清膏（4、8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87 細胞 24h 后，收集細胞，用濃度為1μg/ml吖啶橙室溫條件下避光染色20min，離心之后棄染液，用1×PBS清洗3次后，PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測，F(xiàn)L3通道檢測紅色熒光，F(xiàn)L1通道檢測綠色熒光，紅色熒光增強說明細胞內(nèi)酸性自噬小體增多。

1.2.5 RT-PCR 檢測 Beclin-1、LC3-II、PTENmRNA表達 分別檢測不同濃度的槐耳作用NCI-N87細胞24h后，按照說明書操作，用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度，并行純度驗證、電泳鑒定，然后進行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進行Real-Time PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳進行分離，凝膠成像分析系統(tǒng)行密度分析。GAPDH作為內(nèi)參照。目的基因mRNA表達量以各目的基因片段密度值／內(nèi)參照密度值的比值表示。Beclinl基因上游引物5’-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3’， 下游引物 5’-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3’。LC3-II上游引物 5’-ACCATGCCGTCGGAGAAG3’； 下游引 物 5’ -ATCGTTCTATTATCACCGGGATTT-3’。PTEN上游引物 5’-TCACCAACTGAAGTGCCTAA AGA-3’；下游引物 5’-CTCCATTCCCCTAACCCGA-3’。 GAPDH 上游引物 5’-GTAAAGACCTCTATG CCATCA-3’；下游引物 5’-GGACTCATCGTACTC CTGCT-3’。

1.2.6 Westernblot檢測 Beclin-1、LC3-II、PTEN 蛋白表達 取對數(shù)生長期的NCI-N87細胞，并用不同濃度槐耳清膏(8、16、32mg/ml)處理細胞 24h；實驗前2h用含有2%胎牛血清的RPMI-1640預(yù)處理細胞，收集處理后的細胞，加入裂解液，冰上裂解30min后，超聲破碎，4℃、離心10min，轉(zhuǎn)速15000r/min，取上清，采用BCA法測定蛋白質(zhì)含量，SDSPAGE凝膠電泳，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，分別加入 Beclin-1、LC3-II、PTEN 一抗 4℃過夜、山羊抗兔二抗30℃溫育1h后顯色，用數(shù)字成像儀對圖像進行拍照和分析。上述實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 槐耳清膏對NCI-N87細胞增殖影響 槐耳清膏（4、8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87 細胞 24、48、72h后， 與對照組相比，8、16、32mg/ml對胃癌細胞有抑制增殖作用，并以濃度和時間依賴的方式抑制細胞增殖（P＜0.05），而低濃度組 4mg/ml未顯現(xiàn)明顯抑制作用。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度槐耳清膏作用不同時間后對胃癌細胞NCI-N87存活的影響（）

表1 不同濃度槐耳清膏作用不同時間后對胃癌細胞NCI-N87存活的影響（）

注：與對照組比較，★P＜0.05；與同組 24h 比較，◆P＜0.05；與同組 48h比較，#P＜0.05。

1.02±0.19 0.88±0.18 0.51±0.08★◆#0.42±0.06★◆#0.32±0.02★◆#組別對照組4mg/ml 8mg/ml 16mg/ml 32mg/ml 24h 1.06±0.23 0.95±0.18 0.78±0.17★0.63±0.19★0.42±0.04★48h 72h 1.04±0.41 0.89±0.19 0.64±0.17★◆0.51±0.17★◆0.39±0.09★◆

2.2 槐耳清膏對NCI-N87細胞凋亡率及自噬小體的影響 槐耳清膏（8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87細胞24h后，流式細胞分析結(jié)果顯示，與對照組相比，8、16、32mg/ml濃度能促進 NCI-N87 細胞凋亡，自噬小體形比例增加。（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 槐耳清膏對胃癌細胞NCI-N87凋亡率及自噬小體的影響（，%）

表2 槐耳清膏對胃癌細胞NCI-N87凋亡率及自噬小體的影響（，%）

注：與對照組比較，★P＜0.05。

自噬小體/%4.89±0.67 9.84±1.87 12.47±2.87 17.45±3.81組別對照組8mg/ml 16mg/ml 32mg/ml細胞凋亡率/%3.23±0.45 8.78±1.78 11.65±2.48 16.28±3.58

2.3 槐耳清膏對NCI-N87細胞相關(guān)自噬蛋白表達的影響 通過RT-PCR和Western blot對自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-II、PTEN mRNA和蛋白水平進行了檢測，結(jié)果表明，與對照組相比，槐耳清膏作用 NCI-N87 細胞 24h 后，Beclin-1、LC3-II、PTEN mRNA水平和蛋白表達水平逐漸升高，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)果見圖 1、圖 2、圖 3 及圖 4。

3 討論

圖1 不同濃度槐耳清膏對NCI-N87細胞Beclin-1mRNA表達水平影響

圖2 不同濃度槐耳清膏對NCI-N87細胞LC3-II mRNA表達水平影響

圖3 不同濃度槐耳清膏對NCI-N87細胞PTEN mRNA表達水平影響

圖4 槐耳清膏對NCI-N87細胞Beclin-1、LC3-II、PTEN蛋白表達影響

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，在因腫瘤而死亡的患者中，胃癌占第二位[7，8]。HER2在胃癌中的陽性表達率為3.9%-51.1%，HER2的過表達與胃癌的Bormann分型、Lauren分型、腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)的狀態(tài)、靜脈清潤等有關(guān)，而與腫瘤的大小、清潤的深度及腫瘤的分期無關(guān)[9]。

自噬不僅參與了正常細胞生長發(fā)育、同時也參與了細胞的成熟分化及死亡的調(diào)控，自噬活性的改變經(jīng)?？梢娪谝恍┠[瘤細胞，影響了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4，6]。

大量研究表明，槐耳具有抗腫瘤活性，可以抑制血管及腫瘤形成、抗腫瘤耐藥、抑制癌轉(zhuǎn)移、激活免疫系統(tǒng)以及誘導(dǎo)凋亡等[10，11]。最近也有研究報告，槐耳清膏能誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生自噬及凋亡，其機制可能是通過抑制MTOR/S6K通路有關(guān)[12]，另有研究結(jié)果表明，槐耳清膏對胃癌MKN-45細胞增值及凋亡均有影響[13]，但能否影響her-2陽性胃癌細胞自噬尚未見相關(guān)報道。

在本研究中，我們以高表達her-2的NCI-N87胃癌細胞株為研究對象，通過研究不同濃度的槐耳清膏在處理細胞不同時間后，對NCI-N87細胞增殖、凋亡及相關(guān)自噬蛋白表達的影響。

研究中我們首先觀察到，大于4mg/ml濃度的槐耳清膏對于細胞的增殖具有明顯的影響，在我們觀察的24、48、72h內(nèi)，隨著時間延長其抑制作用增加，呈現(xiàn)質(zhì)量濃度和時間的依賴關(guān)系。胞質(zhì)內(nèi)大量的酸性自噬小體形成是自噬的重要特征，本實驗通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)自噬小體和細胞凋亡率均增加，且與濃度相關(guān)。上述的研究結(jié)果表明，槐耳清膏能影響NCI-N87增殖、凋亡及自噬，從而能在體外影響NCI-N87細胞，發(fā)揮抑癌作用。

有研究表明，細胞自噬受到自噬基因的調(diào)控，如 Beclin-1、LC3-II、PTEN。

有研究報道自噬相關(guān)蛋白Beclin-1在胃癌組織和正常組織中出現(xiàn)表達差異，正常組織陽性表達高于胃癌組織，是與自噬相關(guān)的抑癌基因，它作為激活自噬信號通路的關(guān)鍵蛋白之一，可以調(diào)控凋亡信號通路，從而誘導(dǎo)癌細胞的凋亡[14]。并且進一步的研究表明Beclin-1的蛋白表達水平也與胃癌組織的分化程度相關(guān)[15，16]。另外，自噬體的形成需要多種蛋白質(zhì)復(fù)合體和小分子的參與，其標志性蛋白是LC3，LC3介導(dǎo)的自噬作用在胃癌中至關(guān)重要[17]。LC3共分為 LC3-I和 LC3-II兩型，其LC3-I和LC3-II的含量和比值變化能夠反映細胞的自噬活性[18]。在惡性程度高的胃癌患者中，Beclin-1表達呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而LC3-II的蛋白表達則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，兩者均與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。而PTEN基因作為一個具有脂性磷酸酯酶活性的抑癌基因，可通過PI3KAKT-mTOR通路和PI3K/AKT通路抑制脂性磷酸酶活性，從而促進細胞的自噬過程。因此，PTEN蛋白被認為是誘導(dǎo)自噬發(fā)生的正向調(diào)節(jié)分子，這也提示了PTEN通過自噬對抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展具有重大意義[20，21]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大于4mg/ml濃度的槐耳清膏作用 NCI-N87 24h 后，Beclin-1、LC3-II、PTEN在mRNA水平及蛋白水平均明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義，且與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性。從上述結(jié)果我們推測，槐耳清膏可能影響自噬基因Beclin-1表達，同時增加PTEN表達，導(dǎo)致自噬發(fā)生，較高濃度的槐耳清膏效果明顯，但超過32mg/ml是否自噬效應(yīng)增加尚沒有試驗結(jié)果證明。

綜上所述，槐耳清膏能夠在體外促進NCIN87自噬和凋亡，同時能夠抑制NCI-N87細胞增殖，在一定的濃度及作用時間范圍內(nèi)兩者呈正相關(guān)關(guān)系。其可能的機制是槐耳清膏可能影響自噬基因Beclin-1表達，同時增加PTEN表達，導(dǎo)致自噬發(fā)生。由于自噬的機制甚為復(fù)雜，在本研究中槐耳清膏是否影響自噬相關(guān)信號通路改變，尚不清楚，能否在體內(nèi)發(fā)生抑瘤作用也是我們進一步研究的方向。