何麗云，張樹林，崔百元，朱慶鋒，劉圣杰，劉文華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東 廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣東 廣州 510640）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球半數(shù)以上人口以大米為主食。在我國(guó)，水稻種植面積達(dá)3 000 萬(wàn)hm2，約占所有糧食作物種植面積的27%，年均總產(chǎn)量占世界稻谷總產(chǎn)量的35.3%，居世界首位[1]。由稻瘟病菌〔Magnaporthe oryzae，無(wú)性態(tài)：Pyricularia grisea （Cooke） Sacc〕引起的稻瘟病是一種世界性的水稻病害，它與白葉枯病、紋枯病并稱為水稻三大病害。至今，已有85個(gè)國(guó)家報(bào)道有稻瘟病發(fā)生，全球每年由該病害造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)10%～35%，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元[2-3]。除侵染水稻外，稻瘟病菌也能侵染并危害其他重要的谷類作物，如小麥、小米、高粱、黑麥和玉米等，因此稻瘟病菌被認(rèn)為是世界上最重要的植物病原真菌[4]。此外，稻瘟病菌由于其具有廣泛的遺傳和分子變異性，且與水稻間的相互作用符合基因?qū)蜿P(guān)系，現(xiàn)已成為研究植物-病原菌互作機(jī)制的模式病原菌之一。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及高通量測(cè)序策略的后續(xù)應(yīng)用已成功地為超過(guò)50個(gè)稻瘟病菌分離株做了基因組測(cè)序[5]，稻瘟病菌的生物學(xué)研究進(jìn)入了功能基因組學(xué)時(shí)代。因此，研究基因功能，特別是效應(yīng)子基因功能，在解釋稻瘟病菌的致病機(jī)制和生理特性，以及對(duì)稻瘟病的防治等方面具有重要的理論和實(shí)踐意義。遺傳轉(zhuǎn)化作為一種重要的基因功能研究的輔助手段，可以實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，進(jìn)而研究該目的基因的功能。

目前，實(shí)現(xiàn)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法包括CaCl2-PEG轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、基因槍法、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法REMI以及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）因操作方便，轉(zhuǎn)化效率高及重復(fù)性好等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。自Bundock等[6]首次應(yīng)用ATMT技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)釀酒酵母的高效轉(zhuǎn)化，隨后，Groot等[7]利用ATMT技術(shù)對(duì)6種絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，這項(xiàng)技術(shù)便得到迅速發(fā)展。目前，利用該方法成功轉(zhuǎn)化的真菌已近100種[8]。2001年，Rho等[9]首次利用ATMT技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)稻瘟病菌的轉(zhuǎn)化，為稻瘟病菌的遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)重要工具。本文對(duì)ATMT技術(shù)的轉(zhuǎn)化原理、特點(diǎn)、步驟、影響因素以及該方法在稻瘟病菌功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期能夠?yàn)榈疚敛【日婢倪z傳轉(zhuǎn)化方面研究提供相關(guān)的參考。

1 ATMT技術(shù)的轉(zhuǎn)化原理和特點(diǎn)

1.1 轉(zhuǎn)化原理

ATMT是一種依據(jù)農(nóng)桿菌能夠侵染植物的特點(diǎn)將外源基因?qū)胫参锘蚪M中使目的基因表達(dá)的方法，它最初被應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)基因研究中。根癌農(nóng)桿菌屬于革蘭氏陰性土壤桿菌，它能將自身Tumor - inducing（Ti）質(zhì)粒的一段 DNA（T-DNA）經(jīng)傷口轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，從而使植物損傷部位形成冠癭瘤。由于T-DNA在轉(zhuǎn)化過(guò)程中不受序列特異性的影響，因此可借助分子克隆技術(shù)將內(nèi)源的T-DNA替換成外源基因來(lái)完成遺傳轉(zhuǎn)化，最終得到可以表達(dá)外源基因的植物或真菌[10]。已有研究表明，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌等絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的機(jī)理與其介導(dǎo)植物的遺傳轉(zhuǎn)化相類似，都包括農(nóng)桿菌在宿主細(xì)胞上的吸附，Ti質(zhì)粒上的Vir基因的激活，T-DNA切割、包裝、轉(zhuǎn)移和加工等過(guò)程[11]。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通常利用一些酚類化合物，如乙酰丁香酮（AS），誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上Vir基因的表達(dá)，合成T-DNA轉(zhuǎn)移所需的一些蛋白質(zhì)。VirA和VirG是Vir基因表達(dá)的主控基因，VirA被酚類物質(zhì)激活后自動(dòng)磷酸化并使VirG磷酸化，從而激活其他Vir基因的轉(zhuǎn)錄，合成用于編碼T-DNA加工、轉(zhuǎn)移和整合的功能蛋白[12]。所以，Vir基因的活化是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的開關(guān)，當(dāng)酚類物質(zhì)濃度過(guò)高或者導(dǎo)致Vir基因誘導(dǎo)物減少時(shí)會(huì)對(duì)農(nóng)桿菌產(chǎn)生毒害作用，不利于T-DNA的進(jìn)入或整合[11]。

1.2 轉(zhuǎn)化特點(diǎn)

1.2.1 轉(zhuǎn)化受體多樣性 相比于傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，如PEG-CaCl2法、醋酸鋰法、基因槍法等，ATMT技術(shù)最明顯的優(yōu)點(diǎn)就是其轉(zhuǎn)化受體的多樣性。它除了可以利用原生質(zhì)體作為初始材料外，還可以利用分生孢子，菌絲體和子實(shí)體組織等作為受體，突破了原來(lái)僅依靠原生質(zhì)體完成遺傳轉(zhuǎn)化的局限性，使得整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程方便，易于操作。因此對(duì)一些難以制備原生質(zhì)體的真菌來(lái)說(shuō)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法是一個(gè)較好的選擇。姜寧等[13]以香菇的孢子單核體、原生質(zhì)體單核體和雙核體菌株為轉(zhuǎn)化受體，均獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的香菇轉(zhuǎn)化菌株。2001年，Rho等[9]首次利用ATMT系統(tǒng)成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)稻瘟病菌孢子的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.2 轉(zhuǎn)化高效性 與絲狀真菌的其他轉(zhuǎn)化方法相比，ATMT法轉(zhuǎn)化效率明顯提高，可達(dá)到300～7 200個(gè)轉(zhuǎn)化子/107個(gè)細(xì)胞，是傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化方法的 100～1 000 倍[7，14]。Meyer等[15]研究表明，利用ATMT技術(shù)轉(zhuǎn)化Aspergillus giganteus的分生孢子，其轉(zhuǎn)化效率比PEG法高140倍。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性高 選擇單核的分生孢子作為ATMT轉(zhuǎn)化的初始材料，獲得的轉(zhuǎn)化子相比于其他方法，其轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性更高。M.purpureus的ATMT轉(zhuǎn)化子經(jīng)4輪孢子培養(yǎng)及篩選后，98%的轉(zhuǎn)化子仍然具有潮霉素抗性，而利用PEG方法獲得的轉(zhuǎn)化子，只有60%的轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出對(duì)潮霉素具有抗性[16]。在Agaricus bisporus的50個(gè)ATMT轉(zhuǎn)化子中，經(jīng)過(guò)5輪孢子的培養(yǎng)及篩選后，其中42個(gè)轉(zhuǎn)化子仍然表現(xiàn)出對(duì)潮霉素的抗性，穩(wěn)定性高達(dá)85%[17]。

1.2.4 T-DNA單拷貝插入比例較高 ATMT的非同源轉(zhuǎn)化，通常使T-DNA以單拷貝形式整合到受體菌株的染色體上。研究表明，ATMT法轉(zhuǎn)化的突變體90%以上都是DNA插入引起的[18]，通過(guò)隨機(jī)挑選12個(gè)稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子，其中8個(gè)為單拷貝插入，單拷貝插入頻率達(dá)到66%，而REMI方法轉(zhuǎn)化的Glomerella graminicola突變體DNA 插入不到20%[19]。Guo等[20]通過(guò)PCR擴(kuò)增和Southern雜交表明，在隨機(jī)選擇的56個(gè)稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子中，96%的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子都為單拷貝插入。

ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)也存在一定的缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在：（1）有時(shí)仍會(huì)出現(xiàn)多拷貝插入，給表型分析和基因分離造成困難；（2）工作量大，建立基因組范圍的飽和突變，需要的突變體數(shù)量極大，以稻瘟病菌為例，理論上要建立一個(gè)飽和的水稻稻瘟病菌突變體庫(kù)要3萬(wàn)～4萬(wàn)個(gè)突變體；（3）受寄主范圍限制。

2 ATMT轉(zhuǎn)化稻瘟病菌的步驟

2.1 雙元載體的構(gòu)建及工程菌株的制備

進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，首先需要構(gòu)建符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡碾p元載體。雙元載體上需攜帶適合真菌啟動(dòng)子和終止子的抗性篩選標(biāo)記基因，如潮霉素B基因。通過(guò)設(shè)計(jì)合適的引物擴(kuò)增獲得目的基因片段，再利用酶切和連接的方法，使目的基因片段插入到T-DNA的左、右邊界之間。構(gòu)建好的雙元載體可通過(guò)凍融法或電擊轉(zhuǎn)化法等方法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，從而獲得攜帶外源基因的工程菌株。

2.2 工程菌株的培養(yǎng)與處理

從LB平板上挑取含有雙元載體的農(nóng)桿菌單克隆菌落接種于50 mL含有合適抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取出培養(yǎng)物，按照1∶100比例重懸菌體于IM+AS液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4～6 h，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌OD600為0.3～0.5左右，作轉(zhuǎn)化供體備用。

2.3 稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)與制備

稻瘟病菌接種在米糠或燕麥培養(yǎng)基上，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)10 d左右，促使其產(chǎn)孢。孢子培養(yǎng)后在培養(yǎng)基中加入5 mL滅菌蒸餾水，用無(wú)菌刮勺輕刮洗干菌體表面，洗下孢子，用兩層滅菌擦鏡紙過(guò)濾收集孢子。

2.4 共培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定

將上述農(nóng)桿菌液與孢子液等體積混合，取150 μL混合液均勻涂布在鋪有硝酸纖維濾膜或微孔濾膜并含有AS的IM固體培養(yǎng)基上，22～25 ℃暗培養(yǎng)2～3 d后，將上述膜用無(wú)菌剪刀剪成0.5 cm條狀，正向貼于含有潮霉素B，頭孢霉素和羧芐青霉素的篩選培養(yǎng)基CM上，條與條之間留出適當(dāng)距離，便于轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)。28 ℃下培養(yǎng)4～7 d后挑取轉(zhuǎn)化子至新的篩選培養(yǎng)基上。最后，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增和Southern雜交來(lái)鑒定篩選疑似轉(zhuǎn)化子以及插入T-DNA的拷貝數(shù)。

3 影響ATMT轉(zhuǎn)化效率的主要因素

3.1 乙酰丁香酮AS的濃度

許多研究表明，在ATMT轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)階段需要加入AS來(lái)誘導(dǎo)Vir基因的表達(dá)，因此AS的濃度是整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中最關(guān)鍵的影響因素。在共培養(yǎng)階段，通常AS濃度與ATMT轉(zhuǎn)化效率之間呈現(xiàn)出一個(gè)單峰型曲線的關(guān)系，最適濃度為200～300 μmol/L。例如在對(duì)芽枝霉菌Cladosporium cladosporioides進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，AS的最適濃度為300 μmol/L[21]；在轉(zhuǎn)化淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus和香蕉枯萎菌時(shí)，AS濃度高于200 μmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)效率較高，但過(guò)高的濃度反而會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率[22-23]。但在根癌農(nóng)桿菌的預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中是否一定需要加入AS還未形成定論。例如，在轉(zhuǎn)化在球狀白僵菌，尖孢鐮刀菌時(shí)，預(yù)培養(yǎng)階段不加入AS，會(huì)顯著地影響轉(zhuǎn)化效率[24-25]。然而，也有研究表明，預(yù)培養(yǎng)階段不需要額外AS的加入也可完成轉(zhuǎn)化過(guò)程[26-28]。因此，在對(duì)一種新的真菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要在預(yù)培養(yǎng)階段對(duì)AS的加入與否以及共培養(yǎng)階段AS最佳濃度進(jìn)行探索，以提高轉(zhuǎn)化效率。針對(duì)稻瘟病菌而言，利用ATMT系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，無(wú)論是預(yù)培養(yǎng)階段，還是共培養(yǎng)階段，都需要AS的誘導(dǎo)，且當(dāng)AS濃度在200 μmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高[29]。

3.2 共培養(yǎng)溫度和時(shí)間

共培養(yǎng)溫度和時(shí)間是影響ATMT轉(zhuǎn)化的兩個(gè)重要因素。根癌農(nóng)桿菌侵染完成需要在合適的溫度下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，才能完成轉(zhuǎn)化，溫度過(guò)高或過(guò)低，篩選過(guò)早或過(guò)晚，都不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。Sharma等[27]在白腐菌Phanerochaete chrysosporium的ATMT轉(zhuǎn)化過(guò)程中，設(shè)置20、23、26、29 ℃4個(gè)共培養(yǎng)溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，29 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化完全失敗。Wang等[30]對(duì)土曲霉菌Aspergillus terreus轉(zhuǎn)化時(shí)，分別比較了22、25、28 ℃對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)在25 ℃培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化效率最高，可以達(dá)到350個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子。Liu等[31]在葉斑病菌Curvularia lunata的ATMT轉(zhuǎn)化時(shí)，設(shè)置4個(gè)溫度梯度（19、22、25、28 ℃）及2個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間（24、48 h），結(jié)果表明在19～25 ℃區(qū)間內(nèi)，在這2個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間條件下，轉(zhuǎn)化子均隨著溫度升高而增加，但當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，2個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間獲得轉(zhuǎn)化子的數(shù)量非常少，最終確定最適共培養(yǎng)時(shí)間和溫度為48 h和25 ℃。目前有學(xué)者認(rèn)為ATMT介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化所需溫度為22～25 ℃，但事實(shí)上不同的真菌其溫度并非都在此范圍內(nèi)[32]。

根癌農(nóng)桿菌和真菌都需要在合適的溫度下生存，其轉(zhuǎn)化所需要的酶也只能在特定的溫度下催化效率最高，因此在具體的研究過(guò)程中，需要自己探索出合適的溫度。共培養(yǎng)的時(shí)間過(guò)短，得到的轉(zhuǎn)化子較少，不利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使插入的T-DNA拷貝數(shù)增加，并且潮霉素抑制效果會(huì)減弱，產(chǎn)生背景干擾，導(dǎo)致假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)。例如，地衣真菌Umbilicaria muehlenbergii遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，相比于24 h或36 h的培養(yǎng)時(shí)間，48 h獲得的轉(zhuǎn)化子增加64倍，達(dá)到27～98個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子，但是長(zhǎng)時(shí)間的共培養(yǎng)使得單拷貝T-DNA插入的頻率下降10%～15%[33]。針對(duì)稻瘟病菌，張俊華等[34]發(fā)現(xiàn)，ATMT轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)最適溫度為28 ℃，共培養(yǎng)時(shí)間為4 d，這與之前吳毅歆等[35]的研究結(jié)果類似；而在Rho等[9]的研究中，其ATMT轉(zhuǎn)化采用的共培養(yǎng)時(shí)間為48 h，最適溫度為22 ℃，這可能是與他們采用的農(nóng)桿菌菌株及稻瘟病菌菌株的類型不同有關(guān)，前者所采用的農(nóng)桿菌為C58C1，稻瘟病菌為CY2，而后者采用的農(nóng)桿菌為AGL-1，稻瘟病菌為70-15。

3.3 農(nóng)桿菌菌株類型

在ATMT轉(zhuǎn)化過(guò)程中，轉(zhuǎn)化效率也受根癌農(nóng)桿菌菌株類型的影響。目前較為常用的農(nóng)桿菌菌株有5種，分別是EHA105、AGL-1、LBA1100、LBA4404和C58C1，在不同真菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中，所使用的菌株也不同。Lu等[36]對(duì)玉米灰斑病菌Cercospora zeae-maydis進(jìn)行ATMT轉(zhuǎn)化時(shí)，比較了AGL-1、LBA4404和EHA105菌株的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGL-1的轉(zhuǎn)化效率最高，分別為L(zhǎng)BA4404菌株的4倍、EHA105菌株的2倍。在青霉菌Penicillium chrysogenum的ATMT轉(zhuǎn)化時(shí)，AGL-1菌株的轉(zhuǎn)化效率要比LBA1100菌株高出 2～3 倍[37]。Liu 等[38]在進(jìn)行紫杉醇產(chǎn)生菌Ozonium sp.EFY21的轉(zhuǎn)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)EHA105菌株的效率最高，而AGL-1和LBA4404菌株的轉(zhuǎn)化很少成功甚至得不到轉(zhuǎn)化子。因此，不同真菌的ATMT轉(zhuǎn)化對(duì)農(nóng)桿菌菌株具有一定的選擇性，在具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要進(jìn)行探索找到合適的農(nóng)桿菌菌株。目前在稻瘟病菌的ATMT轉(zhuǎn)化中，常用的農(nóng)桿菌菌株有AGL-1、C58C1和EHA105，針對(duì)這3種農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率比較研究尚未見報(bào)道。

3.4 真菌受體與農(nóng)桿菌的濃度

在一定范圍內(nèi)，隨著真菌受體和農(nóng)桿菌濃度的增加，ATMT轉(zhuǎn)化效率也會(huì)提高。如Zhang等[39]對(duì)蘆筍莖枯病菌Phomopsis asparagi的遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)孢子濃度在103～106CFU/mL范圍內(nèi)，農(nóng)桿菌的OD600值為0.2～0.5時(shí)，轉(zhuǎn)化效率隨著真菌濃度和農(nóng)桿菌增加轉(zhuǎn)化效率也隨之增加，但當(dāng)真菌濃度提高到107CFU/mL時(shí)，或農(nóng)桿菌OD600值為0.6時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率反而顯著下降。Wang等[40]進(jìn)行蘋果腐爛菌的遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，當(dāng)真菌包子濃度為106CFU/mL時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率最高。李敏慧等[23]在對(duì)稻瘟病菌的遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，當(dāng)孢子濃度為106CFU/mL、農(nóng)桿菌的OD600值為0.4時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率最高。Rho等[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)疚敛【咦訚舛群娃r(nóng)桿菌濃度比值為1∶2時(shí)，ATMT的轉(zhuǎn)化效率最高?？傊?，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，當(dāng)農(nóng)桿菌濃度過(guò)高時(shí)，農(nóng)桿菌會(huì)與孢子搶占營(yíng)養(yǎng)，影響孢子萌發(fā)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降。同樣，當(dāng)孢子濃度過(guò)高時(shí)則會(huì)導(dǎo)致真菌的過(guò)量生長(zhǎng)，影響后期轉(zhuǎn)化子的篩選及單克隆轉(zhuǎn)化子的挑取。因此，針對(duì)不同類型的真菌，其ATMT轉(zhuǎn)化的真菌和農(nóng)桿菌的最佳濃度也不同，在具體的研究中，需要對(duì)二者的濃度進(jìn)行探索，進(jìn)而獲得最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。

4 ATMT在稻瘟病菌功能基因組學(xué)中的應(yīng)用

4.1 建立T-DNA插入突變體庫(kù)

在稻瘟病菌功能基因組學(xué)研究中，突變體庫(kù)的容量是開展其基因組學(xué)研究的前提。建立突變體庫(kù)需要高效的轉(zhuǎn)化體系，外源標(biāo)記能夠單拷貝隨機(jī)插入真菌基因組中。利用ATMT法建立稻瘟病菌T-DNA插入突變體庫(kù)，豐富的突變體為突變基因的篩選和致病機(jī)理的研究提供了良好的平臺(tái)。Li等[41]利用ATMT法獲得含6 179個(gè)轉(zhuǎn)化子的稻瘟病菌T-DNA隨機(jī)插入的突變體庫(kù)，通過(guò)Tail-PCR擴(kuò)增，獲得623個(gè)右側(cè)翼序列和124個(gè)左側(cè)翼序列，對(duì)這些序列分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA的插入與染色體重排有關(guān)，且與植物相比其插入模式更精確更單一。Chen等[42]構(gòu)建了容量為70 000個(gè)轉(zhuǎn)化子的稻瘟病菌突變體庫(kù)，利用Tail-PCR擴(kuò)增T-DNA左右側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)轉(zhuǎn)化子SX11404插入了2個(gè)假定基因MGG_01597.5和MGG_11181.5。吳毅歆等[35]構(gòu)建了含8 000個(gè)轉(zhuǎn)化子的稻瘟病菌突變體庫(kù)，通過(guò)接種鑒定轉(zhuǎn)化子的致病性，獲得了20個(gè)致病突變體。Jeon J等[43]對(duì)構(gòu)建的稻瘟病菌突變體庫(kù)通過(guò)高通量表型和基因型的篩選，利用Tail-PCR得到741個(gè)T-DNA標(biāo)記位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了202個(gè)新的致病位點(diǎn)。探索更有效的篩選基因突變體的方法，建立高效率的突變體庫(kù)，是今后稻瘟病菌功能基因組學(xué)研究的一項(xiàng)重要基礎(chǔ)工作。

4.2 目的基因的敲除或定點(diǎn)突變

研究基因功能最直接方式就是對(duì)該基因進(jìn)行基因敲除。將一段目的基因的同源片段連接在T-DNA內(nèi)部的兩側(cè)翼，構(gòu)建目的基因的打靶載體，然后利用ATMT轉(zhuǎn)化法，實(shí)現(xiàn)對(duì)該目的基因的定向失活，得到突變體，再根據(jù)表型變化對(duì)該基因進(jìn)行功能鑒定。Peng等[44]利用ATMT法，獲得稻瘟病菌MoDUO1敲除突變體，突變體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和分生孢子形態(tài)都有著明顯的缺陷，接種水稻后，僅觸發(fā)微小的病變，從而表明MoDUO1是稻瘟病菌發(fā)揮毒性所必需的。Wang等[45]敲除稻瘟病菌致病基因MoCPS1獲得的突變菌株ΔMocps1，發(fā)現(xiàn)該突變菌株的產(chǎn)孢能力明顯下降，僅有野生型的20%，且其孢子的長(zhǎng)度和寬度都顯著不同于野生型，證明了MoCPS1在稻瘟病菌的產(chǎn)孢過(guò)程和分生孢子形態(tài)發(fā)生中具有重要作用。Mogga等[46]對(duì)稻瘟病菌效應(yīng)子MoHEG16敲除后發(fā)現(xiàn)，突變菌株在附著胞形成階段受阻且菌絲的定殖量明顯降低，證明該效應(yīng)子是稻瘟病菌早期侵染階段所必需的。Guo等[20]以Guy11為受體菌株，構(gòu)建了單個(gè)氨基酸替換H245L的突變菌株Mosdi1，與野生型相比，該突變菌株對(duì)農(nóng)藥萎銹靈具有高度抗性。Zhang等[47]通過(guò)構(gòu)建稻瘟病菌無(wú)毒基因AvrPib的單突變或雙突變以及缺失突變等14種突變體，接種鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子的插入以及編碼區(qū)的缺失均導(dǎo)致該基因喪失其無(wú)毒性功能，由此闡明了AvrPib等位基因遺傳多樣性產(chǎn)生的分子機(jī)制。

4.3 標(biāo)記和克隆相關(guān)基因

ATMT法產(chǎn)生的T-DNA插入突變子不僅能穩(wěn)定遺傳，而且大多數(shù)以單拷貝形式整合進(jìn)基因組，基因組DNA不會(huì)發(fā)生重排和切斷現(xiàn)象，這些為高效地獲得標(biāo)記突變體、分離、克隆相關(guān)基因提供了嶄新的途徑。例如，吳小燕等[48]利用ATMT法對(duì)稻瘟病菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得一株致病性增強(qiáng)菌株B11，利用Tail-PCR法獲得了T-DNA插入序列，并成功克隆了相關(guān)基因MgThiJ1，對(duì)該基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該基因可能參與稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)及病斑擴(kuò)展過(guò)程，并且具有一定的負(fù)調(diào)控作用。孔丹丹[49]利用該法獲得一個(gè)稻瘟病菌KD-560突變體，通過(guò)表型鑒定，該突變體不能侵染大麥及水稻葉片，采用hiTAIL-PCR的方法擴(kuò)增了T-DNA右邊界的序列，成功地克隆了相關(guān)基因MoCYP537A3。

5 展望

近20年來(lái)，ATMT作為一種重要的遺傳轉(zhuǎn)化工具，它能夠?qū)⒍鄠€(gè)基因共同轉(zhuǎn)化到真菌細(xì)胞中，目前已被應(yīng)用于由鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas系統(tǒng)所介導(dǎo)的真菌基因組編輯中。尤其是近年來(lái)興起的CRISPR/Cas基因組編輯系統(tǒng)，作為一種新的基因功能研究利器，但ATMT仍然是CRISPR/Cas基因編輯后期實(shí)現(xiàn)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的重要的工具。雖然全面確定真菌中的基因功能，最終發(fā)掘這些基因的潛在意義，這一目標(biāo)短期內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)，但ATMT在定義眾多不同性狀背后的遺傳基礎(chǔ)方面卻取得了許多里程碑式的進(jìn)展，而且它將繼續(xù)為我們對(duì)真菌生物學(xué)的研究發(fā)揮重要的作用。目前，ATMT在很多新的真菌中實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，各種真菌的基因組突變體庫(kù)的構(gòu)建取得很大的進(jìn)展，這些問(wèn)題的解決有利于深入的研究致病基因的功能。然而，目前對(duì)于該技術(shù)的報(bào)道都較為基礎(chǔ)，多數(shù)涉及的是對(duì)轉(zhuǎn)化條件的摸索，而對(duì)進(jìn)一步的相關(guān)基因的篩選及功能驗(yàn)證較少。

ATMT對(duì)稻瘟病菌的生物學(xué)研究有兩個(gè)重要的貢獻(xiàn)：一方面是通過(guò)篩選數(shù)以萬(wàn)計(jì)的T-DNA插入突變體進(jìn)行正向遺傳學(xué)分析；另一方面是建立基因替換菌株，然后在植物上進(jìn)行致病性測(cè)試。這兩方面的研究都是闡明稻瘟病菌致病機(jī)理的重要步驟，所以在具體的研究中，我們有必要建立稻瘟病菌完善、高效的ATMT轉(zhuǎn)化方法，充分的發(fā)揮該方法的優(yōu)點(diǎn)，徹底的弄清稻瘟病菌致病相關(guān)基因的功能，推進(jìn)水稻抗性品種的培育進(jìn)程。雖然，目前對(duì)ATMT轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究相對(duì)清晰，但轉(zhuǎn)化成功與否仍受多方面因素的影響，這就要求研究者對(duì)其條件進(jìn)行探索，本綜述詳細(xì)分析了ATMT轉(zhuǎn)化中的影響因素，可以為未來(lái)的研究者提供一定的參考。