李 卓，張 棋，張雄峰，張啟明，何寬信

（1.江西省煙草科學(xué)研究所，江西 南昌 330000；2.瀘州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，四川 瀘州 646000）

【研究意義】 近紅外光譜輻射區(qū)域介于可見(jiàn)光和中紅外光之間（4 000～12 500 cm-1），輕型原子間的化學(xué)鍵（如C-H，O-H 和N-H）會(huì)發(fā)生振動(dòng)而產(chǎn)生復(fù)雜重疊的倍頻和合頻譜帶[1-2]。近紅外光譜譜帶重疊嚴(yán)重，很難將透射峰直接與特定結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)相對(duì)應(yīng)。近年來(lái)，隨著數(shù)據(jù)處理技術(shù)的豐富，加上近紅外光譜技術(shù)本身具有快速、高效、無(wú)損等特點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及功能性組分的測(cè)定及定量預(yù)報(bào)[3-7]。近紅外輻射比中紅外具有更強(qiáng)的穿透能力，能深入樣品內(nèi)數(shù)毫米，意味著近紅外光譜能反映樣品內(nèi)部的某些信息[8]，為快速無(wú)損檢測(cè)創(chuàng)造了條件。但近紅外數(shù)據(jù)量較大且無(wú)明顯規(guī)律，通常需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)中的信息進(jìn)行提取和利用[9]。淀粉是由D-葡萄糖通過(guò)苷鍵結(jié)合而成的多糖，存在于植物細(xì)胞內(nèi)，尤其是種子、塊莖和塊根等[10]。淀粉也是煙葉中的重要組成部分，煙葉進(jìn)入成熟期后，淀粉會(huì)轉(zhuǎn)化為還原糖和有機(jī)酸，淀粉含量也是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，通常認(rèn)為，淀粉含量越高，煙葉的成熟度越低[11]。目前，煙草行業(yè)主要采用碘顯色法（YC/T 216-2013）對(duì)煙葉中淀粉含量進(jìn)行檢測(cè)，基本原理是：煙葉樣品用80%乙醇-飽和氯化鈉溶液除雜質(zhì)，再用40%高氯酸提取淀粉，酸性條件下淀粉水解生成糊精，糊精與碘發(fā)生顯色反應(yīng)并于570 nm處比色測(cè)定[12]。傳統(tǒng)的碘顯色法需要復(fù)雜耗時(shí)的前處理和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：一方面，整個(gè)淀粉浸提過(guò)程相對(duì)耗時(shí)費(fèi)力；另一方面，由于不同的淀粉（直鏈:支鏈）遇碘顯色不完全相同（呈藍(lán)色或呈紫色）[13]，因此在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)必須按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的淀粉標(biāo)液中直鏈:支鏈1∶4的比例配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，并且由于含有4%的高氯酸，隨時(shí)間的推移淀粉會(huì)逐漸水解[14]，因此標(biāo)液不宜保留過(guò)久?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 近紅外檢測(cè)手段操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，幾乎不消耗試劑、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品，降低了檢測(cè)成本。利用煙葉的近紅外數(shù)據(jù)可建立煙葉產(chǎn)地和等級(jí)的定性識(shí)別模型，也可建立煙葉中某些化學(xué)組分的定量預(yù)報(bào)模型。煙草行業(yè)內(nèi)對(duì)于近紅外檢測(cè)手段的使用也在逐漸增多[15]，上海煙草集團(tuán)、鄭州煙草研究院、云南中煙等單位都建立了各自的近紅外檢測(cè)模型[16-18]，然而很多具體的建模細(xì)節(jié)和方法理論闡述不夠充分，基于江西烤煙的近紅外檢測(cè)模型也尚未有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 本研究以淀粉為例，首次將近紅外預(yù)報(bào)模型建模方法應(yīng)用于江西煙草，收集煙葉樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)化學(xué)分析數(shù)據(jù)，對(duì)近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，消除環(huán)境背景和儀器狀態(tài)導(dǎo)致的噪音和隨機(jī)誤差，再對(duì)高維度的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維并選擇合適的變量，最后建立校正曲線，并驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 旨在通過(guò)近紅外光譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立用于江西烤煙的淀粉近紅外檢測(cè)模型，同時(shí)將建模步驟具體化，并充分闡述方法的理論支撐。本研究對(duì)于江西煙葉的質(zhì)量控制和其他煙草模型的建立具有重大指導(dǎo)和借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇江西2014年和2015年的上（B2F）、中部（C3F）煙葉烤煙樣品共650個(gè)，其中2014年上部煙161個(gè)、中部煙161個(gè)，2015年上部煙164個(gè)、中部煙164個(gè)（表1）。

儀器：配備積分球漫反射采樣系統(tǒng)的近紅外光譜儀（AntarisⅡ型，賽默飛，美國(guó)）；連續(xù)流動(dòng)分析儀（San++，SKALAR，荷蘭）

1.2 樣品制備

先用軟毛刷將煙葉上的細(xì)土和砂粒刷去，抽去主脈，將煙葉用切絲機(jī)切絲，再放入烘箱中，在不高于40 ℃的烘箱中烘干，直至煙絲可用手指捻碎，取出烘好的煙絲，馬上研磨，持續(xù)研磨時(shí)間不應(yīng)超過(guò)2 min，然后用0.42 mm網(wǎng)過(guò)篩，得到粒徑均勻的煙粉樣品[19]。

1.3 光譜數(shù)據(jù)的采集

取10 g煙葉粉末，均勻填裝進(jìn)內(nèi)徑5 cm樣品杯，用銅塊壓實(shí)，然后在FT-NIR分析儀上進(jìn)行漫反射光譜采集。光譜采集時(shí)樣品杯相對(duì)光源入射孔作偏心旋轉(zhuǎn)，掃描次數(shù)64次，分辨率8 cm-1，掃描范圍3 800～12 000 cm-1，步長(zhǎng)為3.86 cm-1。以積分球鍍金內(nèi)壁作為背景，每個(gè)樣品掃描前均掃描背景，掃描次數(shù)同樣為64次，實(shí)驗(yàn)溫度控制在25.0（±1.0）℃。

1.4 化學(xué)分析數(shù)據(jù)的收集

淀粉含量的化學(xué)分析數(shù)據(jù)由連續(xù)流動(dòng)分析儀根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 216-2013檢測(cè)得到[12]。

1.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)正則化 標(biāo)準(zhǔn)正則化（Standard NormalVariate，SNV）常用于消除斜率的影響[20]，首先計(jì)算一條光譜的平均吸光度值，用不同波數(shù)點(diǎn)處的吸光度值與平均吸光度值的差值除以它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差得到不同波數(shù)點(diǎn)處新的吸光度值，繼而得到新的光譜。

表1 烤煙樣品的產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of flue-cured tobacco samples

式中，Xi為第i樣品光譜的平均值，k=1，2…m，m為波長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)；i =1，2 …，n，n為樣品數(shù)。

1.5.2 多元散射校正 多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）常用于減少散射效應(yīng)對(duì)數(shù)據(jù)響應(yīng)的影響[21]，首先計(jì)算所有樣品近紅外光譜的平均光譜，然后將平均光譜作為標(biāo)準(zhǔn)光譜，每個(gè)樣品的近紅外光譜與標(biāo)準(zhǔn)光譜進(jìn)行一元線性回歸運(yùn)算，求得各光譜相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)光譜的線性平移量（回歸常數(shù)）和傾斜偏移量（回歸系數(shù)），在每個(gè)樣品原始光譜中減去線性平移量同時(shí)除以回歸系數(shù)修正光譜的基線相對(duì)傾斜，這樣各光譜的基線平移和偏移都可得到修正。

1.5.3 Savitzky-Golay（SG）平滑和 Norris Derivative（ND）平滑 SG平滑又稱移動(dòng)窗口平滑，是一種在時(shí)域內(nèi)基于局域多項(xiàng)式最小二乘法擬合的濾波方法，利用中心點(diǎn)及其前、后各w個(gè)點(diǎn)進(jìn)行最小二乘擬合，新點(diǎn)其實(shí)是這個(gè)窗口內(nèi)各點(diǎn)的線性組合，由不同權(quán)值的2w+1個(gè)點(diǎn)進(jìn)行加權(quán)而得。這種平滑方法最大的特點(diǎn)在于在濾除噪聲的同時(shí)可以確保信號(hào)的形狀和寬度不變。ND平滑又稱直接差分法，是一種最簡(jiǎn)單的離散波譜求導(dǎo)方法，常常用于原始光譜求導(dǎo)前消除光譜變換帶來(lái)的噪音[22]。

1.5.4 朗伯比爾定律和多元線性回歸 朗伯比爾定律（Lambert-Beer’s law，LBL）是光吸收的基本定律，是一元線性回歸，當(dāng)光程和光波長(zhǎng)確定時(shí)，吸光度只與物質(zhì)的濃度成正比。多元線性回歸（Multiple Linear Regression，MLR）是一元線性回歸在處理兩個(gè)或者兩個(gè)以上變量時(shí)的擴(kuò)展，實(shí)際應(yīng)用中往往存在多個(gè)重要因素的影響，因此在建模中的使用價(jià)值大于一元線性回歸[23]。

1.5.5 經(jīng)典最小二乘回歸 經(jīng)典最小二乘回歸（Classical Least-Squares Regression，CLSR）是通過(guò)最小化誤差的平方和尋找數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配[24]。利用最小二乘法可以簡(jiǎn)便地求得未知的數(shù)據(jù)，并使得這些求得的數(shù)據(jù)與實(shí)際數(shù)據(jù)之間誤差的平方和為最小，由此得到回歸直線，該方法外標(biāo)法分析檢測(cè)中最常用的回歸方式。

1.5.6 逐步多元線性回歸 逐步多元線性回歸（Stepwise Multiple Linear Regression，SMLR）是將變量逐個(gè)引入模型，進(jìn)行F檢驗(yàn)，并對(duì)已經(jīng)選入的解釋變量逐個(gè)進(jìn)行t檢驗(yàn)，當(dāng)原來(lái)引入的解釋變量由于后面解釋變量的引入變得不再顯著時(shí)，可將其刪除，保證回歸方程中只包含顯著性變量。直到既沒(méi)有顯著的解釋變量選入回歸方程也沒(méi)有不顯著的解釋變量從回歸方程中剔除為止[25]。

1.5.7 主成分回歸 主成分回歸（Principal Component Regression，PCR）通過(guò)奇異值分解將原始的圖譜數(shù)據(jù)矩陣分解成得分矩陣、載荷矩陣和殘差矩陣，即將原數(shù)據(jù)的特征變量進(jìn)行線性組合，轉(zhuǎn)化成一組稱作為主成分（PCs）的正交變量，是響應(yīng)和獨(dú)立變量之間最小方差的超平面。主成分回歸能對(duì)原始變量進(jìn)行降維，并最大限度的保留原始數(shù)據(jù)信息，并能解決共線性問(wèn)題和變量數(shù)限制問(wèn)題，可以用于復(fù)雜體系的回歸[26-27]。

1.5.8 偏最小二乘回歸 偏最小二乘法回歸（Partial Least-Squares Regression，PLSR）是集主成分分析和多元線性回歸優(yōu)點(diǎn)的一種回歸方法。它與主成分分析法都試圖提取出反映數(shù)據(jù)變異的最大信息，主成分分析法只考慮一個(gè)自變量數(shù)據(jù)矩陣X，而偏最小二乘法還考慮響應(yīng)數(shù)據(jù)矩陣Y，因矩陣X和Y都會(huì)投影到新空間，因此預(yù)測(cè)結(jié)果往往優(yōu)于主成分回歸[28-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇不同數(shù)據(jù)前處理方法的模型效果

在進(jìn)行粉末樣品的近紅外漫反射光譜采集時(shí)，由于樣品的均勻性和尺寸顆粒不同，光程也不一樣，因此需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理以消除光程的影響，常用的方法有SNV和MSC。圖1A和1B分別是煙葉樣品的近紅外原始光譜和SNV光譜，可以看到經(jīng)SNV處理后，光譜偏移得到了很大改善。另外導(dǎo)數(shù)處理也可以一定程度消除基線偏移還可以分離重疊信息。圖1C和圖1D分別是樣品的一階和二階導(dǎo)數(shù)光譜，可以看出，相比原始光譜，基線差異明顯減小且重疊信息得到了分離。但高階導(dǎo)數(shù)處理在放大信息的同時(shí)也會(huì)放大噪聲，因此在導(dǎo)數(shù)處理之前通常還要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波（平滑）處理。濾波的作用是減小噪聲，提高信噪比，我們選擇了SG和ND兩種濾波方式。如表2所示，在進(jìn)行了不同的光程類型方式、平滑方法和導(dǎo)數(shù)階數(shù)的組合建模后，我們發(fā)現(xiàn)選擇MSC+ND（5，5）+一階導(dǎo)數(shù)的組合建立的模型具有最小的均方根誤差和最大的相關(guān)系數(shù)。

2.2 選擇不同波數(shù)區(qū)間的模型效果

樣品的近紅外光譜掃描范圍為3 800～12 000 cm-1，步長(zhǎng)為3.86 cm-1，有多達(dá)2 127個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其中既包含與目標(biāo)檢測(cè)物相關(guān)的有效信息，也包含很多影響擬合結(jié)果的無(wú)用信息，選擇波數(shù)區(qū)間太寬，雖然能夠保留較多的樣品信息，但同時(shí)也會(huì)引入大量的噪音和冗余信息，反而會(huì)使模型的預(yù)測(cè)效果變差，選擇波數(shù)區(qū)間太窄又會(huì)造成信息的丟失和不全，不能完全提取樣品代表性的特征信息，因此需要對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行取舍。波數(shù)區(qū)間的選擇對(duì)模型至關(guān)重要，是建模過(guò)程中最難以確定的環(huán)節(jié)，它完全取決于建模樣品的實(shí)際模型效果，需要反復(fù)嘗試不同波段；除了要考慮模型的匹配程度，還要考慮模型的兼容性，因此在進(jìn)行波數(shù)選擇時(shí)，盡可能要選擇波數(shù)區(qū)間段，而不是離散的波數(shù)點(diǎn)，并且要避免選擇干擾較大的區(qū)間。圖2B標(biāo)出了C-H，O-H 和N-H等官能團(tuán)的振動(dòng)倍頻和合頻譜帶，參考這些譜帶波段，我們選擇了10種波數(shù)區(qū)間或區(qū)間組合用來(lái)建立模型。如表3所示，當(dāng)波數(shù)區(qū)間選為4 000～4 500 cm-1和5 800～6 400 cm-1的組合時(shí)，模型具有最小的均方根誤差和最大的相關(guān)系數(shù)。根誤差和最大的相關(guān)系數(shù)。LBL、MLR、SMLR、CLSR的誤差較大，RMSEC均在2以上，且相關(guān)系數(shù)很差，可能有以下原因：首先LBL要求吸光物質(zhì)為均勻非散射體系，吸光質(zhì)點(diǎn)之間無(wú)相互作用，因此對(duì)于復(fù)雜體系使用價(jià)值有限；MLR雖然可以容納更多的變量數(shù)，但仍不適用于非散射體系；SMLR雖然可以對(duì)變量進(jìn)行篩選，但是也會(huì)出現(xiàn)共線性的問(wèn)題；CLSR常用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是也會(huì)受共線性的問(wèn)題的影響。PCR的回歸效果也不及PLSR，這可能是：雖然PCR通過(guò)數(shù)據(jù)降維產(chǎn)生新變量（主成分）解決了共線性問(wèn)題和變量數(shù)限制問(wèn)題，但是參與回歸的主成分不一定一定與樣品性質(zhì)有關(guān)，因此預(yù)報(bào)能力有限，而PLSR特征向量與樣品性質(zhì)直接相關(guān)，在保證奇異值影響不大的情況下，預(yù)測(cè)能力往往好于主成分回歸，更適用于復(fù)雜體系的回歸。

圖1 所有樣品的近紅外原始光譜（A）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化光譜（B）、一階導(dǎo)數(shù)光譜（C）、二階導(dǎo)數(shù)光譜（D）Fig.1 NIR(A), SNV(B), first derivative (C)and second derivative(D) spectra of all samples

表2 不同數(shù)據(jù)前處理方法組合參數(shù)的模型效果Table 2 Model effects of combination parameters of different data pretreatment methods

表3 不同波數(shù)區(qū)間的模型效果Table 3 Model effects of different wavenumber intervals

表4 不同回歸方式的模型效果Table 4 Model effects of different regression types

2.4 主成分?jǐn)?shù)的選擇

PLSR需要在評(píng)估均方根誤差的基礎(chǔ)上選擇主成分?jǐn)?shù)，以盡可能少的主成分來(lái)反映原樣本空間最大的信息。圖2是均方根誤差隨主成分?jǐn)?shù)變化的曲線圖，在主成分?jǐn)?shù)為9時(shí)，均方根誤差達(dá)最小，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.1%。

圖2 選擇主成分?jǐn)?shù)的碎石圖Fig.2 The gravel map for selecting principal components

3 討論

比較了不同的光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理方法、波數(shù)區(qū)間、回歸方式、主成分?jǐn)?shù)后，確定了最佳的建模參數(shù)，如表5所示。圖3A是模型的回歸直線，橫坐標(biāo)為化學(xué)檢測(cè)值、縱坐標(biāo)為模型預(yù)報(bào)值，所有樣品均集中在擬合直線附近，沒(méi)有明顯的離群值，模型相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9652，校正均方根誤差為0.407，預(yù)測(cè)均方根誤差為0.490。圖3B是模型預(yù)測(cè)值和化學(xué)檢測(cè)值的相對(duì)偏差分布，均在15%以內(nèi)，將樣品的相對(duì)偏差以0為中點(diǎn)，每隔2%分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如圖3B所示，樣品的偏差分布接近高斯曲線，一定程度上反映了模型的穩(wěn)定性。

表5 江西烤煙近紅外淀粉模型信息Table 5 Information of NIR model for starch content in Jiangxi flue-cured tobacco

圖3 淀粉模型的PLS回歸圖（A）與相對(duì)偏差散點(diǎn)圖（B）Fig.3 PLS regression plot of the starch NIR model(A), scatter diagram of relative deviation （B）

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的實(shí)用性，隨機(jī)選擇40個(gè)外部樣品，通過(guò)比較它們的化學(xué)分析值和近紅外模型預(yù)報(bào)值，評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)效果，規(guī)定相對(duì)偏差＜10%為預(yù)報(bào)結(jié)果通過(guò)。如表6所示，絕大部分樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果良好，相對(duì)偏差較小，只有兩個(gè)樣品的預(yù)測(cè)相對(duì)偏差超過(guò)10%，預(yù)報(bào)通過(guò)率達(dá)到95%，表現(xiàn)了模型良好的預(yù)測(cè)效果。

表6 外部樣品的模型驗(yàn)證結(jié)果Table 6 The model verification results of external samples

（續(xù)表6）

4 結(jié)論

本文利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)江西省煙葉樣品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并確定了定量模型的相關(guān)參數(shù)，最終建立了用于江西烤煙淀粉含量的近紅外定量分析模型，該模型的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9652，校正均方根誤差為0.407，預(yù)測(cè)均方根誤差為0.490，外部樣品驗(yàn)證通過(guò)率達(dá)到95%以上，預(yù)測(cè)效果良好。該方法相比于傳統(tǒng)的連續(xù)流動(dòng)分析法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低廉的優(yōu)勢(shì)，可以較為準(zhǔn)確地檢測(cè)江西省煙葉中的淀粉含量，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。