李 卓，張 棋，張雄峰，張啟明，何寬信

（1.江西省煙草科學研究所，江西 南昌 330000；2.瀘州市環(huán)境監(jiān)測中心站，四川 瀘州 646000）

【研究意義】 近紅外光譜輻射區(qū)域介于可見光和中紅外光之間（4 000～12 500 cm-1），輕型原子間的化學鍵（如C-H，O-H 和N-H）會發(fā)生振動而產(chǎn)生復雜重疊的倍頻和合頻譜帶[1-2]。近紅外光譜譜帶重疊嚴重，很難將透射峰直接與特定結構的官能團相對應。近年來，隨著數(shù)據(jù)處理技術的豐富，加上近紅外光譜技術本身具有快速、高效、無損等特點，被廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品中營養(yǎng)物質(zhì)及功能性組分的測定及定量預報[3-7]。近紅外輻射比中紅外具有更強的穿透能力，能深入樣品內(nèi)數(shù)毫米，意味著近紅外光譜能反映樣品內(nèi)部的某些信息[8]，為快速無損檢測創(chuàng)造了條件。但近紅外數(shù)據(jù)量較大且無明顯規(guī)律，通常需要結合化學計量學方法對數(shù)據(jù)中的信息進行提取和利用[9]。淀粉是由D-葡萄糖通過苷鍵結合而成的多糖，存在于植物細胞內(nèi)，尤其是種子、塊莖和塊根等[10]。淀粉也是煙葉中的重要組成部分，煙葉進入成熟期后，淀粉會轉化為還原糖和有機酸，淀粉含量也是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標之一，通常認為，淀粉含量越高，煙葉的成熟度越低[11]。目前，煙草行業(yè)主要采用碘顯色法（YC/T 216-2013）對煙葉中淀粉含量進行檢測，基本原理是：煙葉樣品用80%乙醇-飽和氯化鈉溶液除雜質(zhì)，再用40%高氯酸提取淀粉，酸性條件下淀粉水解生成糊精，糊精與碘發(fā)生顯色反應并于570 nm處比色測定[12]。傳統(tǒng)的碘顯色法需要復雜耗時的前處理和實驗準備：一方面，整個淀粉浸提過程相對耗時費力；另一方面，由于不同的淀粉（直鏈:支鏈）遇碘顯色不完全相同（呈藍色或呈紫色）[13]，因此在配制標準溶液時必須按照行業(yè)標準規(guī)定的淀粉標液中直鏈:支鏈1∶4的比例配制標準溶液，并且由于含有4%的高氯酸，隨時間的推移淀粉會逐漸水解[14]，因此標液不宜保留過久?！厩叭搜芯窟M展】 近紅外檢測手段操作簡單、檢測快速，幾乎不消耗試劑、樣品、標準品，降低了檢測成本。利用煙葉的近紅外數(shù)據(jù)可建立煙葉產(chǎn)地和等級的定性識別模型，也可建立煙葉中某些化學組分的定量預報模型。煙草行業(yè)內(nèi)對于近紅外檢測手段的使用也在逐漸增多[15]，上海煙草集團、鄭州煙草研究院、云南中煙等單位都建立了各自的近紅外檢測模型[16-18]，然而很多具體的建模細節(jié)和方法理論闡述不夠充分，基于江西烤煙的近紅外檢測模型也尚未有報道?！颈狙芯壳腥朦c】 本研究以淀粉為例，首次將近紅外預報模型建模方法應用于江西煙草，收集煙葉樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)和對應化學分析數(shù)據(jù)，對近紅外光譜數(shù)據(jù)進行預處理，消除環(huán)境背景和儀器狀態(tài)導致的噪音和隨機誤差，再對高維度的近紅外光譜數(shù)據(jù)進行降維并選擇合適的變量，最后建立校正曲線，并驗證模型的準確性和穩(wěn)定性?！緮M解決的關鍵問題】 旨在通過近紅外光譜技術和化學計量學方法建立用于江西烤煙的淀粉近紅外檢測模型，同時將建模步驟具體化，并充分闡述方法的理論支撐。本研究對于江西煙葉的質(zhì)量控制和其他煙草模型的建立具有重大指導和借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇江西2014年和2015年的上（B2F）、中部（C3F）煙葉烤煙樣品共650個，其中2014年上部煙161個、中部煙161個，2015年上部煙164個、中部煙164個（表1）。

儀器：配備積分球漫反射采樣系統(tǒng)的近紅外光譜儀（AntarisⅡ型，賽默飛，美國）；連續(xù)流動分析儀（San++，SKALAR，荷蘭）

1.2 樣品制備

先用軟毛刷將煙葉上的細土和砂粒刷去，抽去主脈，將煙葉用切絲機切絲，再放入烘箱中，在不高于40 ℃的烘箱中烘干，直至煙絲可用手指捻碎，取出烘好的煙絲，馬上研磨，持續(xù)研磨時間不應超過2 min，然后用0.42 mm網(wǎng)過篩，得到粒徑均勻的煙粉樣品[19]。

1.3 光譜數(shù)據(jù)的采集

取10 g煙葉粉末，均勻填裝進內(nèi)徑5 cm樣品杯，用銅塊壓實，然后在FT-NIR分析儀上進行漫反射光譜采集。光譜采集時樣品杯相對光源入射孔作偏心旋轉，掃描次數(shù)64次，分辨率8 cm-1，掃描范圍3 800～12 000 cm-1，步長為3.86 cm-1。以積分球鍍金內(nèi)壁作為背景，每個樣品掃描前均掃描背景，掃描次數(shù)同樣為64次，實驗溫度控制在25.0（±1.0）℃。

1.4 化學分析數(shù)據(jù)的收集

淀粉含量的化學分析數(shù)據(jù)由連續(xù)流動分析儀根據(jù)行業(yè)標準YC/T 216-2013檢測得到[12]。

1.5 化學計量學方法

1.5.1 標準正則化 標準正則化（Standard NormalVariate，SNV）常用于消除斜率的影響[20]，首先計算一條光譜的平均吸光度值，用不同波數(shù)點處的吸光度值與平均吸光度值的差值除以它們的相對標準偏差得到不同波數(shù)點處新的吸光度值，繼而得到新的光譜。

表1 烤煙樣品的產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of flue-cured tobacco samples

式中，Xi為第i樣品光譜的平均值，k=1，2…m，m為波長點數(shù)；i =1，2 …，n，n為樣品數(shù)。

1.5.2 多元散射校正 多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）常用于減少散射效應對數(shù)據(jù)響應的影響[21]，首先計算所有樣品近紅外光譜的平均光譜，然后將平均光譜作為標準光譜，每個樣品的近紅外光譜與標準光譜進行一元線性回歸運算，求得各光譜相對于標準光譜的線性平移量（回歸常數(shù)）和傾斜偏移量（回歸系數(shù)），在每個樣品原始光譜中減去線性平移量同時除以回歸系數(shù)修正光譜的基線相對傾斜，這樣各光譜的基線平移和偏移都可得到修正。

1.5.3 Savitzky-Golay（SG）平滑和 Norris Derivative（ND）平滑 SG平滑又稱移動窗口平滑，是一種在時域內(nèi)基于局域多項式最小二乘法擬合的濾波方法，利用中心點及其前、后各w個點進行最小二乘擬合，新點其實是這個窗口內(nèi)各點的線性組合，由不同權值的2w+1個點進行加權而得。這種平滑方法最大的特點在于在濾除噪聲的同時可以確保信號的形狀和寬度不變。ND平滑又稱直接差分法，是一種最簡單的離散波譜求導方法，常常用于原始光譜求導前消除光譜變換帶來的噪音[22]。

1.5.4 朗伯比爾定律和多元線性回歸 朗伯比爾定律（Lambert-Beer’s law，LBL）是光吸收的基本定律，是一元線性回歸，當光程和光波長確定時，吸光度只與物質(zhì)的濃度成正比。多元線性回歸（Multiple Linear Regression，MLR）是一元線性回歸在處理兩個或者兩個以上變量時的擴展，實際應用中往往存在多個重要因素的影響，因此在建模中的使用價值大于一元線性回歸[23]。

1.5.5 經(jīng)典最小二乘回歸 經(jīng)典最小二乘回歸（Classical Least-Squares Regression，CLSR）是通過最小化誤差的平方和尋找數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配[24]。利用最小二乘法可以簡便地求得未知的數(shù)據(jù)，并使得這些求得的數(shù)據(jù)與實際數(shù)據(jù)之間誤差的平方和為最小，由此得到回歸直線，該方法外標法分析檢測中最常用的回歸方式。

1.5.6 逐步多元線性回歸 逐步多元線性回歸（Stepwise Multiple Linear Regression，SMLR）是將變量逐個引入模型，進行F檢驗，并對已經(jīng)選入的解釋變量逐個進行t檢驗，當原來引入的解釋變量由于后面解釋變量的引入變得不再顯著時，可將其刪除，保證回歸方程中只包含顯著性變量。直到既沒有顯著的解釋變量選入回歸方程也沒有不顯著的解釋變量從回歸方程中剔除為止[25]。

1.5.7 主成分回歸 主成分回歸（Principal Component Regression，PCR）通過奇異值分解將原始的圖譜數(shù)據(jù)矩陣分解成得分矩陣、載荷矩陣和殘差矩陣，即將原數(shù)據(jù)的特征變量進行線性組合，轉化成一組稱作為主成分（PCs）的正交變量，是響應和獨立變量之間最小方差的超平面。主成分回歸能對原始變量進行降維，并最大限度的保留原始數(shù)據(jù)信息，并能解決共線性問題和變量數(shù)限制問題，可以用于復雜體系的回歸[26-27]。

1.5.8 偏最小二乘回歸 偏最小二乘法回歸（Partial Least-Squares Regression，PLSR）是集主成分分析和多元線性回歸優(yōu)點的一種回歸方法。它與主成分分析法都試圖提取出反映數(shù)據(jù)變異的最大信息，主成分分析法只考慮一個自變量數(shù)據(jù)矩陣X，而偏最小二乘法還考慮響應數(shù)據(jù)矩陣Y，因矩陣X和Y都會投影到新空間，因此預測結果往往優(yōu)于主成分回歸[28-29]。

2 結果與分析

2.1 選擇不同數(shù)據(jù)前處理方法的模型效果

在進行粉末樣品的近紅外漫反射光譜采集時，由于樣品的均勻性和尺寸顆粒不同，光程也不一樣，因此需要對光譜數(shù)據(jù)進行預處理以消除光程的影響，常用的方法有SNV和MSC。圖1A和1B分別是煙葉樣品的近紅外原始光譜和SNV光譜，可以看到經(jīng)SNV處理后，光譜偏移得到了很大改善。另外導數(shù)處理也可以一定程度消除基線偏移還可以分離重疊信息。圖1C和圖1D分別是樣品的一階和二階導數(shù)光譜，可以看出，相比原始光譜，基線差異明顯減小且重疊信息得到了分離。但高階導數(shù)處理在放大信息的同時也會放大噪聲，因此在導數(shù)處理之前通常還要對數(shù)據(jù)進行濾波（平滑）處理。濾波的作用是減小噪聲，提高信噪比，我們選擇了SG和ND兩種濾波方式。如表2所示，在進行了不同的光程類型方式、平滑方法和導數(shù)階數(shù)的組合建模后，我們發(fā)現(xiàn)選擇MSC+ND（5，5）+一階導數(shù)的組合建立的模型具有最小的均方根誤差和最大的相關系數(shù)。

2.2 選擇不同波數(shù)區(qū)間的模型效果

樣品的近紅外光譜掃描范圍為3 800～12 000 cm-1，步長為3.86 cm-1，有多達2 127個數(shù)據(jù)點，其中既包含與目標檢測物相關的有效信息，也包含很多影響擬合結果的無用信息，選擇波數(shù)區(qū)間太寬，雖然能夠保留較多的樣品信息，但同時也會引入大量的噪音和冗余信息，反而會使模型的預測效果變差，選擇波數(shù)區(qū)間太窄又會造成信息的丟失和不全，不能完全提取樣品代表性的特征信息，因此需要對原始光譜數(shù)據(jù)進行取舍。波數(shù)區(qū)間的選擇對模型至關重要，是建模過程中最難以確定的環(huán)節(jié)，它完全取決于建模樣品的實際模型效果，需要反復嘗試不同波段；除了要考慮模型的匹配程度，還要考慮模型的兼容性，因此在進行波數(shù)選擇時，盡可能要選擇波數(shù)區(qū)間段，而不是離散的波數(shù)點，并且要避免選擇干擾較大的區(qū)間。圖2B標出了C-H，O-H 和N-H等官能團的振動倍頻和合頻譜帶，參考這些譜帶波段，我們選擇了10種波數(shù)區(qū)間或區(qū)間組合用來建立模型。如表3所示，當波數(shù)區(qū)間選為4 000～4 500 cm-1和5 800～6 400 cm-1的組合時，模型具有最小的均方根誤差和最大的相關系數(shù)。根誤差和最大的相關系數(shù)。LBL、MLR、SMLR、CLSR的誤差較大，RMSEC均在2以上，且相關系數(shù)很差，可能有以下原因：首先LBL要求吸光物質(zhì)為均勻非散射體系，吸光質(zhì)點之間無相互作用，因此對于復雜體系使用價值有限；MLR雖然可以容納更多的變量數(shù)，但仍不適用于非散射體系；SMLR雖然可以對變量進行篩選，但是也會出現(xiàn)共線性的問題；CLSR常用于構建標準曲線，但是也會受共線性的問題的影響。PCR的回歸效果也不及PLSR，這可能是：雖然PCR通過數(shù)據(jù)降維產(chǎn)生新變量（主成分）解決了共線性問題和變量數(shù)限制問題，但是參與回歸的主成分不一定一定與樣品性質(zhì)有關，因此預報能力有限，而PLSR特征向量與樣品性質(zhì)直接相關，在保證奇異值影響不大的情況下，預測能力往往好于主成分回歸，更適用于復雜體系的回歸。

圖1 所有樣品的近紅外原始光譜（A）、標準正態(tài)化光譜（B）、一階導數(shù)光譜（C）、二階導數(shù)光譜（D）Fig.1 NIR(A), SNV(B), first derivative (C)and second derivative(D) spectra of all samples

表2 不同數(shù)據(jù)前處理方法組合參數(shù)的模型效果Table 2 Model effects of combination parameters of different data pretreatment methods

表3 不同波數(shù)區(qū)間的模型效果Table 3 Model effects of different wavenumber intervals

表4 不同回歸方式的模型效果Table 4 Model effects of different regression types

2.4 主成分數(shù)的選擇

PLSR需要在評估均方根誤差的基礎上選擇主成分數(shù)，以盡可能少的主成分來反映原樣本空間最大的信息。圖2是均方根誤差隨主成分數(shù)變化的曲線圖，在主成分數(shù)為9時，均方根誤差達最小，累計貢獻率達到99.1%。

圖2 選擇主成分數(shù)的碎石圖Fig.2 The gravel map for selecting principal components

3 討論

比較了不同的光譜數(shù)據(jù)預處理方法、波數(shù)區(qū)間、回歸方式、主成分數(shù)后，確定了最佳的建模參數(shù)，如表5所示。圖3A是模型的回歸直線，橫坐標為化學檢測值、縱坐標為模型預報值，所有樣品均集中在擬合直線附近，沒有明顯的離群值，模型相關系數(shù)達到0.9652，校正均方根誤差為0.407，預測均方根誤差為0.490。圖3B是模型預測值和化學檢測值的相對偏差分布，均在15%以內(nèi)，將樣品的相對偏差以0為中點，每隔2%分別進行統(tǒng)計，如圖3B所示，樣品的偏差分布接近高斯曲線，一定程度上反映了模型的穩(wěn)定性。

表5 江西烤煙近紅外淀粉模型信息Table 5 Information of NIR model for starch content in Jiangxi flue-cured tobacco

圖3 淀粉模型的PLS回歸圖（A）與相對偏差散點圖（B）Fig.3 PLS regression plot of the starch NIR model(A), scatter diagram of relative deviation （B）

為進一步驗證模型的實用性，隨機選擇40個外部樣品，通過比較它們的化學分析值和近紅外模型預報值，評價模型的預測效果，規(guī)定相對偏差＜10%為預報結果通過。如表6所示，絕大部分樣品的預測結果良好，相對偏差較小，只有兩個樣品的預測相對偏差超過10%，預報通過率達到95%，表現(xiàn)了模型良好的預測效果。

表6 外部樣品的模型驗證結果Table 6 The model verification results of external samples

（續(xù)表6）

4 結論

本文利用化學計量學方法對江西省煙葉樣品的光譜數(shù)據(jù)進行處理并確定了定量模型的相關參數(shù)，最終建立了用于江西烤煙淀粉含量的近紅外定量分析模型，該模型的相關系數(shù)達到0.9652，校正均方根誤差為0.407，預測均方根誤差為0.490，外部樣品驗證通過率達到95%以上，預測效果良好。該方法相比于傳統(tǒng)的連續(xù)流動分析法具有操作簡單、檢測快速、成本低廉的優(yōu)勢，可以較為準確地檢測江西省煙葉中的淀粉含量，具有很強的實用價值。