周 劍，王 磊，儲(chǔ) 彬

破骨細(xì)胞的骨吸收作用和成骨細(xì)胞的骨形成作用在骨骼發(fā)育、骨量平衡及骨損傷的修復(fù)中至關(guān)重要[1]。骨骼通過(guò)不斷地骨重建來(lái)實(shí)現(xiàn)自身的代謝更新，使骨的吸收與形成處于動(dòng)態(tài)平衡。在大多數(shù)骨代謝疾病中，如骨質(zhì)疏松癥、骨Paget's病、牙周病和腫瘤的溶骨性轉(zhuǎn)移，由于破骨細(xì)胞數(shù)量的增加或活性的增強(qiáng)導(dǎo)致骨吸收過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而引起病理性骨流失[2]。鐵是生物體維持穩(wěn)態(tài)的重要元素，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞通過(guò)攝取轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞鐵血紅素、鐵蛋白或通過(guò)非轉(zhuǎn)鐵蛋白獲得鐵[3]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由Slc40a1基因編碼的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋(ferroportin, Fpn)是目前唯一確定的能夠排出細(xì)胞鐵的通道蛋白[4]，未利用的細(xì)胞鐵既可以儲(chǔ)存在鐵蛋白中，也可以通過(guò)Fpn排出。Slc40a1基因的突變會(huì)導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性疾病——血色素沉著癥[5]，這是一種鐵超負(fù)荷類疾病。近期已有學(xué)者研究[6]證明，下調(diào)Fpn的mRNA表達(dá)水平對(duì)破骨細(xì)胞有重要的影響，為了進(jìn)一步探討Fpn在骨髓譜系細(xì)胞中的缺失是否影響破骨細(xì)胞的分化，該研究建立了基因敲除小鼠模型，在體外觀察Fpn在骨髓譜系細(xì)胞中的缺失對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 本實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；鼠重組細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)(美國(guó)Peprotech公司)；胰酶細(xì)胞消化液(美國(guó)Life Technologies公司)；10×青霉素-鏈霉素-L-谷氨酰胺、牛血清白蛋白、破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphase, TRAP)染色試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；磷酸緩沖鹽溶液(美國(guó)Diamedix公司)；RNeasy mini試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)；High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems/Thermo-Fisher Scientific公司)；TaqMan Universal Master Mix(美國(guó)Applied Biosystems公司)；RIPA緩沖液、小鼠抗組織蛋白酶K單克隆抗體、小鼠抗α微管蛋白單克隆抗體(美國(guó)MilliporeSigma公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物公司)；小鼠抗NFATc1單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗PGC-1β多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.1.2儀器 CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；雙目顯微鏡(美國(guó)Olympus公司)；光學(xué)顯微鏡(美國(guó)Carl Zeiss公司)；Step One Plus熒光定量PCR儀(美國(guó)Life Technologies公司)；微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo scientific公司)；PCR 擴(kuò)增儀、微孔檢測(cè)儀、垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1骨髓巨噬細(xì)胞及破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 2月齡小鼠用CO2處死后，取雙側(cè)股骨及脛骨骨髓，室溫下紅細(xì)胞裂解液裂解5 min，在一個(gè)100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)接種5×106個(gè)骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages, BMMs)，并加入α-10 MEM和M-CSF，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次。4～5 d后獲得M-CSF依賴性BMMs。

將兩種小鼠的BMMs接種于多孔細(xì)胞培養(yǎng)板中或培養(yǎng)皿內(nèi)，同時(shí)加入含有M-CSF和RANKL(100 ng/ml)的α-10 MEM誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第2天后每天換液1次并收集細(xì)胞，即可獲得破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(pre-osteoclasts, pOCs)和成熟的破骨細(xì)胞(osteoclasts, OCs)。

1.2.2TRAP染色及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 如上述細(xì)胞培養(yǎng)法，將兩種小鼠的BMMs接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)(塑料組)及含有骨片的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)(骨片組)。塑料組分為兩組(3 d和4 d)，骨片組只有一組(4 d)。每孔細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/ml，每種細(xì)胞設(shè)5個(gè)副孔。同時(shí)加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)分化，于第3天和第4天從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，TRAP(一種破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物)染色：在含有亞硝酸鈉、堿性副品紅溶液及萘酚AS-BI磷酸鹽的NaK酒石酸鹽溶液中36 ℃孵育10～15 min，雙蒸水洗3次后風(fēng)干，光鏡下觀察。

計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組2組細(xì)胞分別在100倍視野下每孔隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。成熟的破骨細(xì)胞呈現(xiàn)大圓片狀，粉紅或玫瑰紅色，細(xì)胞核≥3個(gè)。上述實(shí)驗(yàn)每種細(xì)胞6個(gè)孔，即重復(fù)6次。

1.2.3熒光實(shí)時(shí)定量PCR 如前所述細(xì)胞培養(yǎng)法，將兩種小鼠的BMMs培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為BMMs組、pOCs組及OCs組，每組6個(gè)孔(實(shí)驗(yàn)組3個(gè)孔，對(duì)照組3個(gè)孔)，BMMs組中僅加入M-CSF，而pOCs組及OCs組中加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化。每孔細(xì)胞密度為15×104個(gè)/ml。分別于第2天取出BMMs組及pOCs組和第4天取出OCs組，每孔加入350 μl RLT溶液，收集細(xì)胞裂解液。使用RNeasy mini試劑盒提取全RNA，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒將全RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以線粒體基因Mrps2作為內(nèi)參基因，引物從美國(guó)Life Technologies公司購(gòu)買：Acp5(Mm00475698_m1)，NFATc1(Mm00479445_m1)，Ppargc1b(Mm00504720_m1)，Mrps2(Mm03991065_g1)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其破骨細(xì)胞標(biāo)記基因Acp5(編碼TRAcP)、Nfatc1(編碼破骨細(xì)胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子NFATc1)和Ppargc1b(編碼PGC-1β)中mRNA的表達(dá)量。PCR程序參數(shù)如下：50 ℃、2 min，95 ℃、 10 min，然后進(jìn)行40個(gè)95 ℃、15 s及60 ℃、18 s的循環(huán)。反應(yīng)完成后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析，基因表達(dá)量以檢測(cè)基因的初始模板量以2-ΔΔCt表示。

1.2.4Western blot 如前所述細(xì)胞培養(yǎng)法，將兩種小鼠的BMMs培養(yǎng)在100 mm培養(yǎng)皿中，分為BMMs組、pOCs組及OCs組，每組2個(gè)培養(yǎng)皿(實(shí)驗(yàn)組1個(gè)，對(duì)照組1個(gè))，BMMs組中僅加入M-CSF，而pOCs組及OCs組中加入M-CSF和RANKL誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化。每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞密度為1.5×106個(gè)/ml。分別于第2天取出BMMs組及pOCs組和第4天取出OCs組，經(jīng)RIPA裂解后，搖床上冰鎮(zhèn)30 min，14 000 r/min、4 ℃、離心15 min，提取上清液。再用BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度后，按1 ∶4比例加入蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer)，95 ℃煮5 min。SDS-PAGE檢測(cè)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的相關(guān)蛋白CTSK、NFATc1和PGC-1β的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1TRAcP染色

2.1.1在細(xì)胞培養(yǎng)板上觀察 對(duì)48孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞分別于第3天和第4天進(jìn)行細(xì)胞固定，然后行TRAcP染色，通過(guò)t檢驗(yàn)結(jié)果如下：① 在第3天時(shí)，對(duì)照組中可見(jiàn)大量TRAP染色陽(yáng)性的小圓細(xì)胞，而成熟的破骨細(xì)胞TRAP陽(yáng)性率為8.76%(73/817)，實(shí)驗(yàn)組已有部分形成大的多核的TRAP染色陽(yáng)性的成熟破骨細(xì)胞，陽(yáng)性率為43.17%(376/853)，見(jiàn)圖1、表1；② 在第4天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組已有大量TRAcP染色陽(yáng)性的多核的成熟破骨細(xì)胞形成，陽(yáng)性率為84.75%(700/830)，而對(duì)照組僅有部分破骨細(xì)胞形成，陽(yáng)性率為31.32%(249/783)，見(jiàn)圖1、表1。

2.1.2在骨片上觀察 養(yǎng)在骨片上的細(xì)胞在第4天行細(xì)胞固定，TRAcP染色后可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組已有大量TRAcP染色陽(yáng)性的多核的成熟破骨細(xì)胞形成，而對(duì)照組僅有部分破骨細(xì)胞形成，見(jiàn)圖1。

2.1.3細(xì)胞計(jì)數(shù) 顯微鏡下對(duì)2.1.1實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)板中的成熟破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，如表1及圖2所示，結(jié)果如下：① 第3天，實(shí)驗(yàn)組中成熟的破骨細(xì)胞數(shù)為(376±75)個(gè)，對(duì)照組為(73±32)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 047 51)；② 在第4天，實(shí)驗(yàn)組中成熟的破骨細(xì)胞數(shù)為(700±58)個(gè)，對(duì)照組為(249±22)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 000 96)。

圖1 兩組BMMs分別培養(yǎng)在48孔細(xì)胞培養(yǎng)板與骨片上并行TRAP染色 ×1 000

A、B：對(duì)照組分別于第3天和第4天在培養(yǎng)板上行TRAcP染色；D、 E：實(shí)驗(yàn)組分別于第3天及第4天在培養(yǎng)板上行TRAcP染色；C、F：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別于第4天在骨片上行TRAcP染色

表1 TRAP染色的計(jì)數(shù)結(jié)果

圖2 對(duì)TRAP染色陽(yáng)性的成熟破骨細(xì)胞的計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較：***P<0.001

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCRRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中BMMs、pOCs及OCs三組細(xì)胞中的破骨細(xì)胞標(biāo)記基因Acp5(編碼TRAP)、Ctsk、NFATc1(編碼破骨細(xì)胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子NFATc1)和Ppargc1b(編碼PGC-1β)的mRNA相對(duì)表達(dá)量，RT-PCR結(jié)果顯示：① 在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中，隨著破骨細(xì)胞分化的逐漸成熟，其相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量逐漸增加；② 在pOCs組及OCs組，實(shí)驗(yàn)組Acp5、Ctsk、NFATc1的mRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；③ 在OCs組，實(shí)驗(yàn)組Ppargc1b的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；④ 雖然在pOCs組中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間Ppargc1b的mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但實(shí)驗(yàn)組Ppargc1b的mRNA表達(dá)水平仍高于對(duì)照組，見(jiàn)圖3、表2。

表2 RT-PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中標(biāo)記基因mRMA表達(dá)量的P值

2.3Westernblot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中BMMs組，pOCs組及OCs組三組細(xì)胞的CTSK、NFATc1和PGC-1β蛋白表達(dá)量，結(jié)果如下：① 在BMMs組中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的CTSK、NFATc1、PGC-1β蛋白表達(dá)量均極低，說(shuō)明基本上不表達(dá)CTSK、NFATc1、PGC-1β蛋白；② 在pOCs組，實(shí)驗(yàn)組三種蛋白的表達(dá)量已開(kāi)始高于對(duì)照組；③ 但在OCs組，實(shí)驗(yàn)組中僅NFATc1及PGC-1β的蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)圖4。

圖3 RT-PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞標(biāo)記基因的mRNA的表達(dá)水平

A：Acp5(編碼TRAcP)中mRNA的表達(dá)水平；B： Ctsk中mRNA的表達(dá)水平；C： Ppargc1b(編碼PGC-1β)中mRNA的表達(dá)水平；D：Nfatc1(編碼破骨細(xì)胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子NFATc1)中mRNA的表達(dá)水平

圖4 通過(guò)Western blot檢測(cè)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

A: 用tubulin作為內(nèi)參，檢測(cè)CTSK(1 μg/μl)蛋白的表達(dá)水平; B: 用tubulin作為內(nèi)參，檢測(cè)NFATc1(1 μg/μl)和PGC-1β(1 μg/μl)蛋白的表達(dá)水平; m:巨噬細(xì)胞；p:破骨細(xì)胞前體細(xì)胞；oc:成熟的破骨細(xì)胞

3 討論

Fpn也被稱為Slc40a1，在2000年由Donovan et al[7]首先發(fā)現(xiàn)，并發(fā)表于Nature雜志。目前已經(jīng)證明Fpn是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)排出鐵的唯一通道蛋白[4]，并有大量的研究[8]證明其在鐵代謝平衡中具有重要作用。人的Fpn基因定位在2號(hào)染色體上，長(zhǎng)度20 bp，并有8個(gè)外顯子，其mRNA的5'末端非翻譯區(qū)含有一個(gè)典型的鐵反應(yīng)元件IRE[7]。Fpn mRNA編碼的蛋白有570個(gè)氨基酸，分子量約62 ku，至少有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種膜蛋白。Fpn蛋白在哺乳動(dòng)物里是一種高度保守的蛋白，人、小鼠、大鼠的序列同源性有 90%～95%[9]。因此，本研究的動(dòng)物模型選擇小鼠。Fpn蛋白廣泛分布在哺乳動(dòng)物的十二指腸、胎盤、肝、腎、肌肉、肺、腦等，參與這些器官的鐵代謝[10]。

研究[6]證明，下調(diào)Fpn的mRNA表達(dá)水平對(duì)破骨細(xì)胞有重要的影響。但本課題組通過(guò)下調(diào)多種基因表達(dá)并研究顯示，基本都對(duì)破骨細(xì)胞的分化存在影響[11-12]，故認(rèn)為這種陽(yáng)性結(jié)果不一定準(zhǔn)確。另外，有研究[13]證明，F(xiàn)pn的種系缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎致死。因此，本研究通過(guò)在骨髓譜系細(xì)胞中特異性敲除Fpn基因，建立了一種全新的基因敲除小鼠模型。取其骨髓巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并加入RANKL及M-CSF(破骨細(xì)胞分化過(guò)程中兩種極其重要的細(xì)胞因子)誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，在顯微鏡下可觀察到Fpn基因敲除的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞加速形成成熟的破骨細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞固定，TRAP染色，計(jì)數(shù)等方法進(jìn)一步證實(shí)了Fpn的缺失對(duì)破骨細(xì)胞的形成分化有著顯著的促進(jìn)作用。

為了明確Fpn的缺失在分子水平上如何影響破骨細(xì)胞的形成分化，本研究通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了幾種破骨細(xì)胞標(biāo)志物，結(jié)果顯示隨著破骨細(xì)胞的形成分化，其標(biāo)志物顯著增加，其中Acp5、Ctsk、NFATc1這幾種標(biāo)志物明顯高于陰性對(duì)照組，Ppargc1b mRNA的表達(dá)量雖然在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞階段升高不具有顯著性，但在成熟破骨細(xì)胞階段其表達(dá)量顯著增加。這些結(jié)果表明Fpn的缺失可能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化形成過(guò)程中的多種細(xì)胞因子的活化，進(jìn)而促進(jìn)骨髓巨噬細(xì)胞分化形成成熟的破骨細(xì)胞。

本研究又通過(guò)Western blot檢測(cè)CTSK、NFATc1及PGC-1β的蛋白含量，進(jìn)一步證實(shí)了RT-PCR結(jié)果的可靠性。NFATc1和PGC-1β(兩種對(duì)破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子)的蛋白含量隨著破骨細(xì)胞的分化逐漸增加，并明顯高于陰性對(duì)照組。然而，CTSK似乎在破骨細(xì)胞分化成熟階段并沒(méi)有顯著升高，這與之前RT-PCR定量Ctsk分析P=0.046相比較，其實(shí)并沒(méi)有多大矛盾。首先RT-PCR表明Ctsk確實(shí)升高，但是相比較其他幾種標(biāo)志物來(lái)說(shuō)增高并不明顯。其次，破骨細(xì)胞在分化形成的過(guò)程中，調(diào)控的通路并不只有一條，也就是說(shuō)并不一定每一種標(biāo)記物都顯著增高，因此本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果具有可靠性。

綜上所述，本研究揭示了在骨髓譜系細(xì)胞中敲除Fpn會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成。至于其是否會(huì)進(jìn)一步對(duì)骨量造成影響，以及對(duì)成骨細(xì)胞是否有正反饋或負(fù)反饋?zhàn)饔?，?duì)鐵量的聚集是否有刺激作用，進(jìn)而引起鐵代謝性疾病，還有待進(jìn)一步的研究。