魏小麗，Ahmed Yaser，趙奇紅，王 華，顧康生

胃癌是世界上主要的惡性腫瘤之一[1]。胃癌患者5年總生存率仍然很低[2]。胃癌的發(fā)病與環(huán)境、基因等因素有關[3]，但其發(fā)病機制仍需闡明。大量研究[4-5]證實miRNAs(microRNAs)參與多種癌癥進程。miR-362-5p已被報道參與肝癌[6]、乳腺癌[7]發(fā)展。然而，miR-362-5p在胃癌中的生物學作用尚不清楚。為此，該課題通過莖環(huán)Real time PCR(RT-PCR)法檢測miR-362-5p在35例胃癌患者術后癌組織中與相應癌旁組織中的表達差異情況，并分析這種表達差異與臨床病理參數(shù)的相關性；同時也分析了miR-362-5p在胃癌細胞系SGC7901、AGS中與胃黏膜細胞系GES-1中的表達差異情況，以此通過重組慢病毒轉染法研究過表達、敲低miR-362-5p對人胃癌細胞及胃黏膜細胞的增殖、遷移能力的影響，為闡明胃癌發(fā)生及轉移等機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 選取2015年在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科手術治療的胃癌患者35例，年齡35～74(56.3±8.9)歲，均經(jīng)術后組織病理檢查明確診斷。所有患者臨床資料完整，術前未接受任何抗腫瘤治療，并排除遠處轉移。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.1.2實驗材料 臨床標本收集使用的RNA later溶液購自美國Thermo Fisher公司；總RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；miRNA逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑以及敲低、過表達慢病毒載體均購自上海吉瑪制藥技術公司；人胃癌細胞系SGC7901、AGS及人胃黏膜上皮細胞GES-1購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素和鏈霉素)、胰酶購自美國Gibco公司；MTT、DMSO購自美國sigma公司；DEPC水購自上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1組織RNA提取 所有組織在離體15 min內(nèi)被置于RNA later溶液中保存，再置于液氮中保存待用。取組織50～100 mg，加1 ml TRIzol，加入DECP水浸泡的磁珠；勻漿至肉眼不可見塊狀物，吸鐵石吸出磁珠；4 ℃離心后，收集上清液至無酶EP管中加氯仿0.2 ml，劇烈震搖15 s，室溫靜置5 min；離心收集上清液加異丙醇0.5 ml，反復搖勻，室溫靜置20 min；離心見RNA沉淀，棄上清液，加75%乙醇1 ml，輕彈管壁，使RNA浮起，重復一次；4 ℃離心后棄上清液，自然干燥5～10 min至RNA變透明；加適量DECP水，稀釋定量。

1.2.2細胞培養(yǎng) 在RPIM-1640培養(yǎng)基中加入終濃度10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，制成完全培養(yǎng)基。用配好的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，將細胞置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育。細胞生長到匯合度80%時棄去原有培養(yǎng)基，PBS沖洗，胰酶消化、傳代、種板。當細胞處于對數(shù)生長期時，將培養(yǎng)基更換至無血清的培養(yǎng)基，來進行后續(xù)實驗。

1.2.3細胞RNA提取 取大皿細胞匯合度90%左右，用冷PBS清洗2遍，加1 ml TRIzol吹打至液體澄清，靜置5 min，將裂解液移至無酶EP管中加氯仿0.2 ml，劇烈震搖15 s，室溫靜置5 min；離心收集上清液加異丙醇，搖勻，靜置，離心見RNA沉淀，棄上清液，加乙醇清洗2次，自然干燥至RNA變透明，加適量DECP水，稀釋定量。

1.2.4RT-PCR 使用Nanodrop 2 000儀器檢測總RNA濃度及純度，記錄每個樣品的濃度，吸光值(absorbance，A)A260/A280的值處于1.8～2.0間，代表RNA純度良好，最后用DEPC水將各組樣品提取的RNA稀釋定量。以U6為內(nèi)參，根據(jù)miRNA逆轉錄試劑盒(Hairpin-itTMmicroRNAs and U6 snRNA Normalization qRT-PCR Quantitation Kit)說明書合成cDNA第一鏈后，在LightCycler 96系統(tǒng)(Roche)上進行PCR擴增，記錄Ct值，檢測miRNA的表達。miRNA的相對表達量用2-ΔCt表示。ΔCt為同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因(U6)Ct 值之差，即ΔCt=CtmiR-362-5p-CtU6；ΔΔCt =ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織或ΔCt胃癌細胞-ΔCt胃黏膜細胞。

1.2.5重組慢病毒轉染 將對數(shù)生長期的細胞種于12孔板中，當細胞匯合度30%～50%時，吸去舊培養(yǎng)基，換成不含血清及雙抗的培養(yǎng)基，將構建好的敲低或過表達miR-362-5p慢病毒載體(含有目的片段、GFP熒光標記、抗嘌呤霉素耐藥基因)，加入培養(yǎng)孔中。24 h后，吸去孔中含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。72 h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白GFP的表達，評估轉染效率。利用嘌呤霉素篩選轉染的細胞以獲得純種的轉染細胞，RT-PCR法驗證細胞目的基因過表達或敲低的效率；培養(yǎng)、傳代、保種，進行后續(xù)實驗。

1.2.6MTT法檢測細胞增殖能力 將處于對數(shù)生長期的SGC7901、AGS、GES-1各組細胞制成單細胞懸液并計數(shù)，使細胞數(shù)約為5×103/L，接種于96孔板中，每孔200 μl細胞懸液；放置在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)0(貼壁后，約4 h)、1、2、3、4、5、6、7 d；每2 d更換培養(yǎng)液；結束培養(yǎng)前4 h，向每孔中加入20 μl的MTT溶液(濃度為5 g/L)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；培養(yǎng)結束后，吸出上清液，向每孔中再加入150 μl DMSO，避光條件下，水平震動10 min；最后在酶標儀上檢測各組細胞在490 nm處的OD值，繪出細胞增殖曲線。

1.2.7劃痕實驗檢測細胞遷移 將處于對數(shù)生長期的SGC7901、AGS、GES-1各組細胞制成單細胞懸液并計數(shù)，接種細胞于6孔板中，置5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁生長匯合度約為80%時，吸取舊液，每孔用槍頭沿著滅菌后的直尺劃出橫豎各兩道線，用PBS液將劃掉的脫落細胞洗去，換成無血清的RPIM-1640培養(yǎng)，分別在顯微鏡下觀察拍攝0 h(即細胞劃痕的初始狀態(tài))、24 h各組細胞的狀態(tài)。利用Image-pro plus 6.0軟件計算劃痕寬度，計算細胞24 h遷移距離。遷移距離(μm)=劃痕寬度0 h(μm)-劃痕寬度24 h(μm)。

2 結果

2.1miR-362-5p在胃癌組織及胃癌細胞中表達較高RT-PCR法分析miR-362-5p在35例胃癌組織中與其相應癌旁組織的表達量，結果顯示：miR-362-5p在胃癌組織的表達明顯高于其相應的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.611，P<0.001，圖1A)。并且PCR結果也顯示，miR-362-5p在胃癌細胞系SGC7901、AGS的表達量均高于胃黏膜細胞GES-1，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.28，P<0.01；t=7.96，P<0.05，圖1B)。

2.2相對于癌旁組織，胃癌組織miR-362-5p的表達量與臨床病理參數(shù)的關系35例胃癌患者中，TNM分期較晚、分化程度較低、有淋巴結轉移的腫瘤中miR-362-5p表達量要高于TNM分期較早、分化程度較高、無淋巴結轉移的腫瘤中。見表1。

表1 胃癌組織miR-362-5p的相對表達

2.3穩(wěn)定細胞系的建立在人胃癌細胞SGC7901、AGS中，轉染敲低miR-362-5p表達的慢病毒載體；而在人胃黏膜細胞GES-1中，轉染過表達miR-362-5p表達的慢病毒載體。通過RT-PCR驗證過表達或敲低效率。結果顯示：miR-362-5p在miR-362-5p-inhibitor載體轉染的SGC7901、AGS細胞中的表達水平分別低于miR-362-5p-control載體轉染的SGC7901、AGS細胞，差異有統(tǒng)計學意義(t=-23.9，P<0.01；t=-10.5，P<0.01；圖2A)。在miR-362-5p-mimics載體轉染的GES-1細胞中miR-362-5p的表達水平明顯高于miR-362-5p-control載體轉染的GES-1細胞，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.5，P<0.05，圖2B)。以上結果提示miR-362-5p過表達、敲低的成功。

圖1 miR-362-5p在胃癌組織及胃癌細胞中的表達

A：miR-362-5p在35例胃癌組織中(相對于相應的癌旁組織)的表達水平；與癌旁組織比較：***P<0.001；B：miR-362-5p在胃癌細胞SGC7901、AGS中的相對表達水平；與胃黏膜細胞GES-1比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4miR-362-5p促進細胞遷移在SGC7901、AGS細胞中敲低miR-362-5p的表達，在GES-1細胞中過表達miR-362-5p，利用劃痕實驗分別檢測各組細胞的遷移能力，結果顯示(圖3)：在SGC7901胃癌細胞24 h遷移距離中，miR-362-5p-inhibitor組為(18±4.60)μm,顯著低于miR-362-5p-control組的(44.82±3.71)μm，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在AGS胃癌細胞24 h遷移距離中，miR-362-5p-inhibitor組為(12.56±3.06)μm,也明顯低于miR-362-5p-control組的(38.77±4.06)μm，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在GES-1胃黏膜細胞24 h遷移距離中，miR-362-5p-mimics組為(30.23±3.65)μm,高于miR-362-5p-control組的(16.89±2.37)μm，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，在人胃癌細胞SGC7901、AGS中敲低miR-362-5p表達后，胃癌細胞的遷移能力顯著下降；而在人胃黏膜細胞GES-1中過表達miR-362-5p后，胃黏膜細胞的遷移能力增強。結果提示miR-362-5p促進胃癌細胞遷移。

圖2 細胞中miR-362-5p敲低、過表達的驗證

A：SGC7901、AGS細胞轉染miR-362-5p-inhibitor載體與轉染miR-362-5p-control載體后miR-362-5p表達水平的變化；B：GES-1細胞轉染miR-362-5p-mimics載體與轉染miR-362-5p-control載體后miR-362-5p表達水平的變化；與miR-362-5p-control組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 miR-362-5p對細胞遷移能力的影響 ×100

2.5miR-362-5p促進細胞增殖利用MTT法檢測細胞增殖能力，結果顯示：在人胃癌細胞SGC7901、AGS中敲低miR-362-5p表達后，胃癌細胞的增殖能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4A、4B)；而在人胃黏膜細胞GES-1中過表達miR-362-5p后，胃黏膜細胞的增殖能力增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4C)。結果表明miR-362-5p促進胃癌細胞增殖。

3 討論

胃癌居世界癌癥死亡率的第3位。較低的診斷和高復發(fā)是影響胃癌患者預后的主要障礙[8]。正常情況下，胃黏膜細胞的代謝、增殖保持在動態(tài)平衡內(nèi)，而維持這種平衡依賴抑癌基因、癌基因及其靶基因的共同調(diào)控。由于胃癌早期缺乏特異性臨床癥狀或無任何癥狀，易被漏診或誤診。因此尋找敏感、特異的分子生物學標志物成為當下研究熱點。

miRNAs是一種長度為19～24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過堿基互補配對與靶基因mRNA的3’-UTR進行堿基配對，調(diào)節(jié)轉錄及轉錄后水平的基因表達，從而導致轉錄抑制或mRNA的降解[9-10]。miRNA調(diào)控的靶基因可以是抑癌基因或癌基因，亦或者是細胞周期進程、分化或凋亡基因[11]，因此異常表達的miRNA便通過異常的正向或反向調(diào)控基因表達，來直接調(diào)控細胞增殖、分化等，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展甚至侵襲轉移。研究表明，多種功能miRNA分子在腫瘤中異常表達，包括胃癌[12]、腎癌[13]、甲狀腺癌[14]等。Ni et al[6]發(fā)現(xiàn)miR-362-5p在肝癌組織中明顯較癌旁組織高表達，并且靶向調(diào)控CYLD表達，從而激活NF-κB信號通路，最終促進肝癌細胞生長和轉移。Ni et al[7]也證實了miR-362-5p的上調(diào)顯著加速了人類乳腺癌MCF7細胞的進展。此外，已有研究證實miR-362-5p是長鏈非編碼RNA CASC2內(nèi)生靶點，miR-362-5p能激活NF-κB通路，CASC2通過靶向miR-362-5p，抑制NF-κB通路，從而抑制肝癌進展。

圖4miR-362-5p對細胞增殖能力的影響

A、B：SGC7901、AGS細胞分別轉染miR-362-5p-inhibitor載體與miR-362-5p-control載體后細胞增殖能力的變化；C：GES-1細胞中轉染miR-362-5p-mimics載體與miR-362-5p-control載體后細胞增殖能力的變化 ；與miR-362-5p-control組比較：*P<0.05

關于miR-362-5p在胃癌中的表達及對胃癌細胞增殖和遷移的影響，相關文獻報道較少。本研究結果顯示miR-362-5p在胃癌組織的表達明顯高于其相應的癌旁組織；且miR-362-5p在胃癌細胞系SGC7901、AGS的表達量均高于胃黏膜細胞GES-1；表明miR-362-5p可能在胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮著癌基因角色。miR-362-5p在TNM分期較晚、分化程度較低、有淋巴結轉移的腫瘤中的表達量要高于TNM分期較早、分化程度較高、無淋巴結轉移的腫瘤，表明腫瘤增殖、浸潤和腫瘤轉移能力越強，miR-362-5p表達量越高。而miR-362-5p在腫瘤中的相對表達量，與患者的年齡、性別均無關。通過重組慢病毒載體轉染，成功構建了穩(wěn)定過表達、敲低miR-362-5p的細胞系。進一步的實驗數(shù)據(jù)顯示，在胃癌細胞SGC7901、AGS中敲低miR-362-5p表達后，細胞的增殖、遷移能力顯著下降；在胃黏膜細胞GES-1中上調(diào)miR-362-5p表達后，細胞的增殖、遷移能力明顯增強。因此，miR-362-5p在胃癌發(fā)展中發(fā)揮癌基因的角色，促進胃癌細胞的增殖、遷移。miR-362-5p有望成為胃癌診斷的分子生物學標志物之一。由于miRNAs作用途徑的多樣性，后期將研究miR-362-5p在胃癌中是通過調(diào)控何種信號通路及靶基因來發(fā)揮促癌作用，從而進一步闡明其在胃癌中的生物學功能及機制。