葉 帥，季 華，趙曉彤，許慕蓉，陳明衛(wèi)

薈萃分析表明，糖尿病患者中結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加近30%[1]。脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌的脂肪因子，具有調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪代謝、抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化、負(fù)性調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用。其在2型糖尿病(T2DM)患者中水平顯著降低，與T2DM發(fā)病密切相關(guān)[2]。近年來(lái)研究[3-4]顯示，血漿脂聯(lián)素濃度的降低可增加CRC的患病風(fēng)險(xiǎn)。目前臨床研究尚不能確定脂聯(lián)素是否為聯(lián)系糖尿病和CRC發(fā)病之間的一個(gè)關(guān)鍵因素。有關(guān)脂聯(lián)素在高糖環(huán)境下對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響也尚不清楚。該研究模擬糖尿病的高糖環(huán)境，用多種濃度脂聯(lián)素刺激結(jié)腸癌細(xì)胞株，觀察增殖、凋亡的變化，以期為今后的結(jié)腸癌診斷和治療找到新的途徑。

1 材料與方法

1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；牛血清白蛋白(BSA)、四甲基偶氮噻唑蘭(MTT)、胰酶消化液、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科技公司)；SB203580(美國(guó)Santa Cruz公司);全長(zhǎng)脂聯(lián)素(美國(guó)R&D公司)；Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物公司)。

1.2SW480結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清、葡萄糖含量為4.5 g/L的DEME培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，1～2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合時(shí)傳代。細(xì)胞傳代2次以上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3實(shí)驗(yàn)分組觀察不同濃度f(wàn)-APN對(duì)在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討p38MAPK信號(hào)通路在f-APN發(fā)揮效應(yīng)中的作用，實(shí)驗(yàn)分為6組：高糖對(duì)照組(0 μg/ml f-APN+高糖，即用葡萄糖含量為4.5 g/L的DEME培養(yǎng)基)、APN1組(10 μg/ml f-APN+高糖)、APN2組(20 μg/ml f-APN+高糖)、APN3組(30 μg/ml f-APN+高糖)、APN+SB組(30 μg/ml f-APN+高糖+10 μmol/L p38MAPK阻滯劑SB203580)、低糖對(duì)照組(低糖，葡萄糖含量為1.0 g/L的DEME培養(yǎng)基)。

1.4MTT法檢測(cè)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞消化后收集細(xì)胞，以每孔6×104個(gè)細(xì)胞均勻鋪在96孔板中，每孔100 μl DMEM培養(yǎng)基，按分組條件干預(yù)24 h、48 h后，每孔加20 μl MTT(濃度為5 mg/ml)，避光孵育4 h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，酶標(biāo)儀490 nmol/L波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡情況胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞后收集細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，按分組條件干預(yù)細(xì)胞24 h、48 h后，依次預(yù)冷的PBS洗滌、離心15 min(4 ℃、1 000 r/min)、固定細(xì)胞(75%乙醇，冰預(yù)冷)、流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡率、Cell Quest軟件分析。

1.6Westernblot測(cè)定f-APN干預(yù)后p-p38MAPK、Caspase-3蛋白的表達(dá)胰酶消化SW480細(xì)胞，以每孔106個(gè)細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，再按分組條件分別干預(yù)24 h、48 h后，依次進(jìn)行提細(xì)胞總蛋白并測(cè)濃度、SDS-PAGE電泳(濃縮膠55 V、30 min,分離膠110 V、 60 min)、轉(zhuǎn)膜(280 mA，恒流75 min)、封閉(5%脫脂牛奶，3 h)、一抗孵育(β-actin，1 ∶1 000；Caspase-3，1 ∶1 000；p-p38MAPK，1 ∶1 000；4 ℃過(guò)夜)、二抗孵育(5%脫脂牛奶：二抗，1 ∶1 600；孵育45 min)、顯影。Quantity One凝膠成像軟件分析相對(duì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1f-APN在高糖環(huán)境下對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，與低糖對(duì)照組比較，24 h、48 h后高糖對(duì)照組OD值均顯著升高(P<0.05)。干預(yù)24 h后，與高糖對(duì)照組、APN1組、APN2組比較，APN3組OD值均顯著降低(P<0.05)。干預(yù)48 h后，與低糖對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組OD值顯著升高(P<0.05)；與高糖對(duì)照組比較，APN1組、APN2、APN3組OD值均顯著降低(P<0.05)；APN2、APN3組OD值較APN1組更低，APN3組OD值低于APN2組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間、不同濃度的f-APN對(duì)SW480細(xì)胞增殖活性的影響

2.2高糖環(huán)境下f-APN對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，24 h后低糖對(duì)照組、高糖對(duì)照組、APN1組、APN2組、APN3組的細(xì)胞凋亡率分別為(3.92±0.63)%、(3.89±0.79)% 、(4.94±0.85)%、(7.43±2.67)%、(8.67±2.75)%。與低糖對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)24 h后，與高糖對(duì)照組比較，APN3組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(F=32.185，P<0.05)，見(jiàn)圖1。而48 h后低糖對(duì)照組、高糖對(duì)照組、APN1組、APN2組、APN3組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.01±0.75)%、(3.96±0.92)% 、(6.21±1.31)%、(8.86±2.83)%、(9.47±3.15)%。與低糖對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)48 h后，與高糖對(duì)照組比較，APN1組、APN2組、APN3組細(xì)胞凋亡率均上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.193，P<0.05)。APN2組、APN3組的細(xì)胞凋亡率較APN1組更高，APN3組的細(xì)胞凋亡率高于APN2組(F=58.193，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3高糖環(huán)境下f-APN對(duì)Caspase-3、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響與高糖對(duì)照組比較，隨著f-APN濃度的增加，p-p38MAPK以及Caspase-3蛋白表達(dá)均呈明顯增高趨勢(shì)。與高糖對(duì)照組比較，APN2組、APN3組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增高，APN3組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)較APN2組更高，APN+SB組p-p38MAPK蛋白表達(dá)低于APN3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.741，P<0.05)，見(jiàn)圖3。與高糖對(duì)照組比較，APN1組Caspase-3蛋白蛋白表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，APN2組、APN3組的Caspase-3蛋白蛋白表達(dá)明顯增高，APN3組的Caspase-3蛋白蛋白表達(dá)較APN2組更高，APN+SB組Caspase-3蛋白表達(dá)低于APN3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.829，P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)24 h后細(xì)胞凋亡A:低糖對(duì)照組;B:高糖對(duì)照組;C:APN1組;D:APN2組;E:APN3組

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)48 h后細(xì)胞凋亡A:低糖對(duì)照組;B:高糖對(duì)照組;C:APN1組;D:APN2組;E:APN3組

圖3 f-APN對(duì)p-p38MAPK、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

1：高糖對(duì)照組；2：APN+SB組；3：APN1組；4：APN2組；5：APN3組

3 討論

糖尿病是以慢性高血糖為顯著特征的代謝性疾病。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，其具體機(jī)制目前尚未闡明。由于葡萄糖是腫瘤細(xì)胞的唯一能量來(lái)源，因此普遍認(rèn)為高血糖可能是促進(jìn)腫瘤發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一。本研究顯示SW480細(xì)胞在高塘環(huán)境下增殖活性明顯增高，也表明了增高的血糖濃度可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌的表達(dá)最豐的激素，其隨著脂肪體積增大而在血液中濃度降低。近年來(lái)有研究顯示，脂聯(lián)素水平的降低增加了多種腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，包括本課題組前期研究在內(nèi)的多項(xiàng)研究[2-3]均顯示，血漿脂聯(lián)素濃度的降低可增加CRC的患病風(fēng)險(xiǎn)。為探究脂聯(lián)素是否為糖尿病患者(伴隨脂聯(lián)素水平降低)CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，在體外高糖環(huán)境下應(yīng)用不同濃度的脂聯(lián)素干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞株，將有助于更清晰地闡明脂聯(lián)素在糖尿病并發(fā)CRC過(guò)程中的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，f-APN對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制作用以及促凋亡效應(yīng)與f-APN濃度以及作用時(shí)間密切相關(guān)。隨著f-APN作用時(shí)間的延長(zhǎng)、濃度的升高，其抑制SW480細(xì)胞增殖以及促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡效應(yīng)增強(qiáng)。提示f-APN以濃度、時(shí)間依賴方式抑制SW480細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這與Nigro et al[5]在其他結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2、HCT116中的研究結(jié)果一致。與此同時(shí)，也有作者研究了脂聯(lián)素和其他腫瘤細(xì)胞的關(guān)系，如人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[6]、胃癌HGC27[7]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)SW480細(xì)胞的結(jié)果與之一致，這也從另一方面解釋了糖尿病患者惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加的原因。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在信號(hào)傳遞途徑中(包括ERK、JNK和p38MAPK等蛋白激酶信號(hào)途徑)有重要作用。脂聯(lián)素可通過(guò)增加腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化的方式使裂原活化蛋白激酶(MAPK)發(fā)揮作用，p38MAPK被認(rèn)為是MAPK多級(jí)蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中主要成員之一，通常被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白激酶。Duarte et al[8]研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK以非磷酸化形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(當(dāng)細(xì)胞在受到體內(nèi)外各種刺激因素，如致炎癥因子、缺血低氧等刺激后)，p38MAPK轉(zhuǎn)化為磷酸化形式而具有活性，而后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，可激活 Caspase家族成員，引起細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞因子的合成，誘導(dǎo)p38-caspase-3 促凋亡通路。有研究[9]表明Caspase-3在結(jié)直腸癌旁正常組織中的表達(dá)水平顯著高于癌組織，且Caspase-3表達(dá)與CRC分期和病理分級(jí)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，f-APN以濃度依賴方式上調(diào)p-p38MAPK蛋白以及Caspase-3蛋白表達(dá)，推測(cè)f-APN抑制SW480細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡的機(jī)制可能與其對(duì)p38MAPK信號(hào)通路的刺激作用以及增加活性Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。此外，本研究顯示，在應(yīng)用f-APN干預(yù)過(guò)程中，p38MAPK激活與Caspase-3活化之間可能存在級(jí)聯(lián)關(guān)系，p38MAPK激活可導(dǎo)致Caspase-3蛋白表達(dá)增加。有研究[10]顯示p38MAPK/Caspase-3依賴的信號(hào)通路在介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中具有重要作用。

綜上所述，f-APN在高糖環(huán)境下以濃度、時(shí)間依賴方式抑制SW480細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與p38MAPK通路的激活和Caspase-3的活化有關(guān)。