鐘毓娟，吳 丹，黃光玲，何 義，蔣蓮秀

共培養(yǎng)體系是指將兩種細胞(可以來自同一組織,也可以來自不同的組織)混合共同培養(yǎng),通過兩種細胞之間的相互作用,觀察細胞共培養(yǎng)后其功能、特性、生長行為等的變化,如某一細胞的分泌物對另外一種細胞基因表達的影響等[1]。研究[2]表明轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1既可通過促進人肝星狀細胞(human hepatic stellate cells，HSC)合成Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白等增加細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成，又可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶合成、促進HSC分泌組織金屬蛋白酶抑制劑而減少ECM降解。課題組前期通過TGF-β1刺激HSC-LX-2建立α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)過表達的細胞模型[3]，在此基礎(chǔ)上，該研究收集人正常肝細胞(human normal liver cell，L-02)細胞上清液與HSC-LX-2細胞間接共培養(yǎng)，以觀察在TGF-β1刺激下L-02上清液對HSC-LX-2細胞α-SMA表達的影響。

1 材料與方法

1.1細胞來源L-02、HSC-LX-2均購自無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2試劑重組人TGF-β1購自美國Novoprotein公司;兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體、鼠抗α-SMA單克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記山羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Hyclone胎牛血清購自美國Thermo公司；雙抗、高糖DMEM培養(yǎng)基購自杭州賽默飛世爾儀器有限公司；普通ECL Plus發(fā)光液購自北京泛博生化公司。

1.3儀器Model311型CO2培養(yǎng)箱、酶標儀(Model450)均購自美國Thermo公司；電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；多通道PCR儀(PTC-220)購自美國MJ公司；核酸蛋白分析儀(PPSQ-31A型)購自日本島津公司；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(JS-780型)購自上海培清科技公司。

1.4方法

1.4.1細胞培養(yǎng) HSC-LX-2、L-02均置于含10%胎牛血清、雙抗(100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4.2L-02上清液的制備 取對數(shù)生長期細胞L-02接種于面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，1.5×106個細胞/瓶，5 ml 10%胎牛血清/瓶，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，收集其細胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心5 min，取其上清液于-20 ℃?zhèn)溆谩ＥR用前把此上清原液用1.4.1中的培養(yǎng)液稀釋，濃度分別為1 ∶2、1 ∶4，分為L-02細胞上清原液、1/2上清液、1/4上清液。

1.4.3MTT法檢測LO2上清液對TGF-β1誘導(dǎo)HSC-LX-2細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期細胞HSC-LX-2接種于96孔板，3×103個細胞/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，分成正常組、模型組、L-02細胞上清原液組、1/2上清液組、1/4上清液組。正常組只含有培養(yǎng)液；模型組含終質(zhì)量濃度為5 μg/L[4]的TGF-β1；上清液各組分別在加入L-02細胞上清原液、1/2上清液、1/4上清液的基礎(chǔ)上，加入終質(zhì)量濃度為5 μg /L 的TGF-β1。繼續(xù)培養(yǎng)68 h后，避光加MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入二甲基亞砜150 μl，室溫下低速振蕩10 min，酶標儀490 nm波長檢測光密度(optical density，OD)值，重復(fù)3次取平均值。利用公式計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=(模型組OD值-上清液組OD值)/模型組OD值×100%。

1.4.4Western blot法檢測HSC-LX-2細胞α-SMA的表達 取對數(shù)生長期細胞HSC-LX-2細胞接種于直徑10 cm的大皿，2×106個細胞/皿，細胞分組、干預(yù)同1.4.3。培養(yǎng)72 h后棄去上清液，冰上用生理鹽水清洗培養(yǎng)皿3次，放射免疫沉淀試驗(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液裂解細胞，收集細胞裂解物。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法檢測各組蛋白含量。取含100 μg 總蛋白的上清液, 100 ℃水煮5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后把蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，5 %脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗脫4次，每次5 min。加入α-SMA一抗(1 ∶500)孵育，室溫孵育2 h后4 ℃搖床過夜(16～18 h)。第2天TBST沖洗4次，每次5 min，再與二抗(1 ∶8 000)室溫作用1 h，TBST沖洗4次，每次5 min，暗室用ECL發(fā)光液發(fā)光顯色，用自動凝膠成像分析系統(tǒng)定量分析印跡。GAPDH為內(nèi)參。

1.4.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測HSC-LX-2細胞α-SMA mRNA的表達 ① 取呈指數(shù)生長的HSC-LX2細胞接種于直徑10 cm的大皿，2×106個細胞/皿，細胞分組、干預(yù)同前;② 用TRIzol法提取HSC-LX2中總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量和純度;③ 取5 μg 總RNA，用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)為cDNA;④ 根據(jù)引物說明書，引物序列：α-SMA：F:5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’;R:TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’;α-actin:F:5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’:R:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA;⑤ PCR擴增，PCR反應(yīng)總體積為20 μl，熱循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；⑥ 分別取10 μl擴增產(chǎn)物和DNA Marker上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，DNA帶進行觀察和紫外線燈拍攝。Gel Doc XR系統(tǒng)檢測OD值，Quantity One軟件進行分析，β-actin為參照物。實驗重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。作圖軟件為GraphPad Prinm5。

2 結(jié)果

2.1L-02上清液對TGF-β1誘導(dǎo)HSC-LX-2細胞增殖的抑制作用L-02上清液作用72 h后，對TGF-β1刺激HSC- LX-2細胞的增殖有一定抑制作用，且與濃度有關(guān)，上清原液的抑制率達到38.90%， 1/2上清液組抑制率為20.82%。見表1。

表1 L-02上清液對TGF-β1誘導(dǎo)HSC- LX-2細胞增殖的影響

2.2L-02上清液對HSC-LX-2細胞α-SMA蛋白表達的影響L-02細胞上清液與HSC- LX-2細胞共培養(yǎng)后，上清原液組、1/2上清液組HSC- LX-2細胞α-SMA蛋白的表達明顯降低(F=44.125，P<0.01)。見圖1。

圖1 L-02上清液對HSC-LX2細胞α-SMA表達的影響

1：正常組；2：模型組；3：上清原液組；4：1/2上清液組；5：1/4上清液組;與正常組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.3對HSC-LX-2細胞α-SMAmRNA的表達L-02細胞上清液與HSC- LX-2細胞共培養(yǎng)后，上清原液組、1/2上清液組中HSC- LX-2細胞α-SMA mRNA的表達降低(F=45.231，P<0.01)。見圖2。

圖2 L-02上清液對HSC-LX-2細胞α-SMA mRNA表達的影響

A：β-actin; B:α-SMA;1：正常組；2：模型組；3：上清原液組；4：1/2上清液組；5：1/4上清液組；與正常組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01

3 討論

在正常肝組織中，各種細胞及ECM有著精確的相對比例和特定的相對空間位置，通過細胞之間、細胞與ECM之間的信號傳遞精確地調(diào)控著結(jié)構(gòu)、功能和代謝狀態(tài)，成為一個相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[5]。肝纖維化(hepatic fibrosis HF)是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，而HSC活化、增殖及轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞則被認為是HF發(fā)生發(fā)展的核心機制[6]。TGF-β1具有細胞黏附、遷移、抑制大多數(shù)細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞分化、調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖與分化、免疫應(yīng)答以及促進ECM與膠原生成等多重的生物學(xué)作用[7],是最主要的促纖維化因子，與 HF 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。TGF-β1可刺激纖維黏連蛋白、膠原等 ECM 成分的合成與分泌，降低ECM 蛋白酶的活性，減少 ECM 降解[8]，刺激HSC活化。 HSC激活后產(chǎn)生大量的肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor HGF)， HGF可以通過減少 TGF-β1合成并抑制其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制 HSC 活化和增殖，使其具有抗纖維化效應(yīng)[9]。L-02具有分泌HGF等多種細胞生長因子[10]的功能。但由肝實質(zhì)細胞直接產(chǎn)生HGF的量很少，主要由肝間質(zhì)細胞產(chǎn)生[11]。本實驗中， HSC-LX-2細胞被TGF-β1激活，模型組HSC-LX-2細胞自身分泌的HGF不能抑制α-SMA蛋白的表達，加入L-02細胞上清液后，隨著上清液濃度的增加，HSC-LX-2細胞的α-SMA及α-SMA mRNA的表達逐漸降低，表明HSC-LX-2細胞自身產(chǎn)生的HGF單獨作用于TGF-β1時，對HSC-LX-2細胞的α-SMA及α-SMA mRNA的表達沒有影響，提示HSC-LX-2細胞自身分泌的HGF需要通過不同細胞的分泌因子、分泌因子和細胞的相互作用等才能發(fā)揮抑制 HSC 活化和增殖的功能，從而抑制蛋白α-SMA的表達。但L-02細胞上清液成分及激活HGF的機制尚待進一步的研究。