杜小燕, 陳柏安, 仵 毅, 郭 萌

(首都醫(yī)科大學實驗動物部, 北京 100069)

隨著科學技術的發(fā)展，轉基因技術在全球飛速進步，尤其是轉基因動物在醫(yī)學和生物學領域取得巨大成就并得到廣泛應用。轉基因動物是利用轉基因技術改造動物性狀后獲得的一類珍貴的動物資源，通過實驗手段將新的遺傳物質導入到動物胚細胞中，并能穩(wěn)定遺傳，由此獲得的動物稱為轉基因動物[1]。自從1980年Gorden完善了顯微注射技術[2]和1982年第一只超級小鼠問世以來[3]，轉基因動物(基因修飾動物)作為人類疾病動物模型開始進入了醫(yī)學研究領域，轉基因(基因修飾)動物及技術在醫(yī)學領域的作用越來越顯著，應用也越來越廣泛，新型基因編輯技術CRISPR/Cas9更被看作下一個諾貝爾獎的熱門[4,5]。因此，讓醫(yī)學院校的研究生了解和掌握轉基因動物領域的前沿技術和發(fā)展動態(tài)，初步掌握轉基因動物的制作方法與技能，將會為其以后的研究工作增加理論和技術儲備。首都醫(yī)科大學實驗動物部面向全校(包括校本部和臨床醫(yī)院)開設了轉基因動物技術這門課程，上課后學生的反響非常好，在此分享開設該課程的體會。

1 針對醫(yī)學研究生開設轉基因動物技術課程的意義

轉基因(基因修飾)動物自誕生伊始就和醫(yī)學緊密相連，可以說醫(yī)學研究離不開轉基因動物技術。從轉基因技術誕生到現在歷經30多年，經過不斷發(fā)展和完善，尤其CRISPR/Cas9技術出現后表現得非常經濟和高效，越來越多的生物醫(yī)學實驗室擁有了自己的轉基因動物制備平臺。

目前世界各地研發(fā)的基因工程品系僅小鼠和大鼠已接近20 000種[6]。在PubMed中查詢表明，利用基因修飾小鼠進行研究的論文達41萬多篇。我們統計了自1983年超級小鼠問世以來含有Knockout mouse和Transgenic mouse的論文，顯示論文數量與發(fā)表時間具有正相關性(圖1)，但從2016年開始有下降趨勢，其原因可能是CRISPR/Cas9等新型基因編輯技術突破了基因敲除局限于小鼠胚胎干細胞操作的瓶頸，除小鼠以外的其他動物包括大型實驗動物的基因修飾研究日新月異，從圖2我們可以看出，大鼠、兔、豬、非人靈長類等實驗動物的研究論文在PubMed中合計達到23 441篇，這些數據顯示基因修飾動物在科學研究的影響力之大和使用范圍之廣，也充分說明CRISPR/Cas9技術使更多類型的動物基因敲除成為可能，近5年更是有了突飛猛進的發(fā)展。

在醫(yī)學研究中, 轉基因動物技術的意義體現在以下兩個方面。首先, 在疾病治療方面，利用轉基因動物技術研究基因治療是重要突破點。1980年代初，科學家首次利用原核顯微注射技術成功將生長激素基因轉入小鼠，獲得了個體幾乎可以和大鼠“媲美”的超級小鼠，預示有了治療人類侏儒癥的希望，也由此為基因治療帶來了生機，科學家們開始了基因治療的探索。最近，科學家們用CRISPR/Cas9 技術制備的質粒結合人造病毒來研究用基因敲除技術治療肝癌[7]; 人們正在試圖用基因修飾的豬胰島進行異源性移植來治療糖尿病的可行性[8]; 科學家利用CRISPR/Cas9技術編輯β-球蛋白來治療鐮刀血病[9]。第二，多種重大疾病的發(fā)病機制、靶點篩選和藥物評價等研究離不開轉基因動物模型。例如: 感染性疾病艾滋病、乙型肝炎等, 退行性神經疾病阿爾茨海默癥、亨廷頓氏病等, 多種類型腫瘤，精神病抑郁癥等，通過轉基因技術，科學家們已制備出越來越多種能夠較好復制人類疾病的動物模型和人源化動物模型, 如將1.3個拷貝的乙型肝炎病毒插入到小鼠基因組，使動物肝臟表達病毒, 獲得小鼠乙型肝炎模型[10]。將人類突變的亨廷頓基因轉入非人靈長類獲得了亨廷頓氏病動物，模型具有人類亨廷頓氏病的典型臨床表型[11]。最近我國科學家又將自閉癥相關基因MECP2轉入猴基因組，建立了第一種轉基因猴自閉癥模型，轉基因猴具有人類自閉癥的臨床表現[12]。其他例如將人類PD-1、CTLA4等基因通過同源重組方法取代小鼠基因獲得的人源化小鼠廣泛應用于腫瘤治療、抗體和免疫調節(jié)劑藥物篩選及評估的研究，利用APOE敲除小鼠制備的動脈粥樣硬化模型，app、ps1、tau等不同突變或聯合突變轉基因大小鼠阿爾茨海默癥模型，多種基因敲除免疫缺陷小鼠等方面的研究更是不勝枚舉。由此可見，轉基因動物是生物醫(yī)學研究中不可或缺的有力武器。

圖 1 基因敲除小鼠、轉基因小鼠和基因修飾小鼠

2 轉基因動物技術課程教學體會

圖 2 利用除小鼠外的其他主要實驗動物在PubMed中發(fā)表文章的數量

2.1 教材建設

雖然轉基因動物技術課程在首都醫(yī)科大學開設已有十余年，但一直都采用教師自行收集材料編寫成冊作為教學材料使用，缺乏面向學生尤其是研究生的教材。2011年我們啟動了教材編寫工作, 在前任教師們編寫手稿的基礎上, 參考了Robert F. Weaver的《分子生物學》、卡爾的《轉基因動物技術手冊》等專著，查閱了近200篇外文文獻，增加了大量較新的技術內容, 例如CRISPR/Cas9和TALEN[transcription activator-like (TAL) effector nucleases]等，于2013年命名為《基因修飾小鼠制備常用技術》，完成了醫(yī)學院校轉基因動物技術課程的教材建設。在該教材中，以小鼠為主要對象，系統闡述了基因修飾動物概述、原核注射法制備轉基因動物、基因敲除小鼠制備、條件性基因敲除、基因捕獲、CRISPR/Cas9和TALEN系統敲除以及基因修飾小鼠繁育和保種等7個章節(jié)的內容，這些內容既方便學習和使用基因修飾小鼠的醫(yī)學生物學研究所及相關科研人員，也基本做到了對國際上最新開發(fā)的基因修飾技術方法的兼收并蓄[13]。

2.2 課程大綱和內容設置

在教學大綱中，我們確定的教學目標為“通過本課程的學習，使學生了解和掌握轉基因動物領域的前沿技術和發(fā)展動態(tài)，初步掌握轉基因動物的制作方法與技能，為以后的研究工作增加理論和技術儲備”。為了實現這樣的目的，我們采用“理論授課、實驗教學以及視頻錄像相結合的方法。使用現代教學手段方面的要求：多媒體教學所需設備儀器以及VCD、錄像帶等”的教學方法。

該課程共28學時，其中理論課10學時，主要介紹轉基因動物基本知識、研究進展、應用領域及研究中存在的問題；實驗課18學時分5次教學，以顯微注射法為例學習和練習轉基因小鼠的制備，包括小鼠的超數排卵、假孕鼠的制備、胚胎收集鑒定、外源基因導入、胚胎移植及胚胎冷凍保存等內容。這樣的課程設計，能讓研究生既學習了轉基因動物的概念、命名、原理等基本知識，也擴展了他們的知識面，擴大視野，了解了顯微注射方法[2]等傳統技術，同時接觸到鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技術[14]、TALEN 靶向基因敲除技術[15]、CRISPR/Cas9技術[5]以及這些技術的優(yōu)勢所在[16]。例如在理論課程中，我們介紹TALAN以及CRISPR/Cas9兩種技術，講解原理和制備方法，并檢索大量應用這些技術的文獻，分析其研究思路。我們還介紹了最新出現的NgAgo(Natronobacterium gregoryiArgonaute) 技術(DNA作為引導工具的基因編輯技術)及與之相關的爭議[17]，力圖將科研誠信教育和科研新思路相結合。為了讓學生有更深刻的印象和豐富實踐，我們充分利用動物部實驗平臺的優(yōu)勢，設計了實驗課優(yōu)勢的學時分配方案，在實驗中學生能從超數排卵到顯微注射法全程進行操作。學生課后都感慨這些操作非常實用和精細，獲益匪淺。

2.3 課程考核方法改革

作為研究生選修課的考核，我們摒棄了過去出題考試或者寫綜述的考試方法，而是利用小班課優(yōu)勢，讓每個研究生根據自己的專業(yè)，按擬定的研究方向或研究內容等查閱轉基因動物應用方面的文獻，從文獻的研究背景、轉基因動物制備思路、轉基因動物在整個研究中的作用、研究結果、有哪些缺陷、如何評價其作用等方面借助PPT進行講述。在設計初始，我們擔心這種改革可能對于涉入科研尚淺的研究生會有困難，但最終教學效果出乎意料地好，同學們不但完成了老師的“規(guī)定動作”，有的還加入多篇同一轉基因動物在該領域的應用研究進行比較。例如一位骨科專業(yè)的學生，以1篇文章為切入點，將本領域中對骨密度相關基因研究的轉基因動物模型及其應用進行了分析和比較，深入淺出地講述讓同學們聽得入迷。這種改革不但幫助學生掌握理論知識，了解本領域新進展，還通過交流激發(fā)了對其他方向的濃厚興趣，為學生與學生、教師與學生之間建立聯系和研究交叉提供了非常好的機會。

雖然轉基因動物在生命科學中發(fā)揮重要作用,基因編輯技術業(yè)已成為生命科學研究中的常用技術手段之一, 但是很多醫(yī)學院校的教師和學生都存在認識誤區(qū), 甚至有些臨床醫(yī)學科研人員和研究生認為，轉基因動物與自己的科研沒有關系。所以盡管上課效果和反響不錯, 但我們的課程選修人數卻不太多。

因此, 我們建議醫(yī)學院校首先應擴大宣傳，讓學生認識到這一技術的重要性。作為將來要從事臨床或基礎研究的醫(yī)學院校研究生，其研究生涯中可能涉及轉基因動物模型。那么, 醫(yī)學研究生們能夠對不同轉基因動物制備方法的原理、優(yōu)缺點以及進展進行了解和學習, 對轉基因動物的命名、繁育、鑒定、保種等知識的了解是非常必要的。第二, 我們還建議在課程中多介紹最新的進展以引起學生的重視和興趣, 例如在教學中每年更新圖1和圖2的數據, 以此凸顯該課程的重要性。2017年我們在教學中介紹了Nature Communication雜志的最新論文[18],學生表現出極大興趣。希望更多醫(yī)學院校能通過本文的闡述了解開設轉基因動物課程的意義和教學實踐，為研究生開設這門課程。