沈 艷, 徐汪洋, 朱后保

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心, 上海 200025)

2-酮戊二酸脫氫酶以及2-酮己二酸脫氫酶廣泛存在于真核細(xì)胞的線粒體中，通過催化氧化還原反應(yīng)最終產(chǎn)生乙酰輔酶A(acetyl-CoA)進(jìn)入三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA), 產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)為機(jī)體提供能量。其中, 脫氫酶E1和轉(zhuǎn)酮酶結(jié)構(gòu)域1(dehydrogenase E1 and transketolase domaincontaining 1，DHTKD1)參與賴氨酸以及色氨酸代謝，催化氨基酸代謝的中間產(chǎn)物2-酮己二酸生成戊二酰輔酶A(glutaryl-CoA)[1]。近年來,DHTKD1基因突變被陸續(xù)報(bào)道與多種遺傳性疾病的發(fā)生有關(guān),包括腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)[2]、氨己二酸酮己二酸尿癥(2-aminoadipic and 2-oxoadipic aciduria，AMOXAD)[1,3,4]和嗜酸細(xì)胞性食管炎(eosinophilic esophagitis，EoE)[5](表 1)。報(bào)道中均指出此類疾病的發(fā)生可能與DHTKD1基因突變所導(dǎo)致的線粒體功能缺陷有關(guān)。

DHTKD1基因位于常染色體10p14[6], 2000年由日本長瀨研究組克隆[7]。DHTKD1基因包含17個(gè)外顯子，編碼框長5 202個(gè)堿基，編碼919個(gè)氨基酸[2]。DHTKD1蛋白與酮戊二酸脫氫酶非常相似，起初被認(rèn)為是酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的E1組分參與三羧酸循環(huán)[6,8,9]。后來被證實(shí)，DHTKD1蛋白催化酮己二酸脫氫反應(yīng)，最終產(chǎn)物乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)[9]。

DHTKD1蛋白參與線粒體能量代謝，它在能量需求旺盛的組織器官中高表達(dá)。小鼠體內(nèi)，DHTKD1在肝臟表達(dá)最高，背根神經(jīng)節(jié)以及脊髓次之, 在腎臟、乳腺以及睪丸中的表達(dá)也相對較高[10]。在人體組織中，正常組織肝臟腎臟表達(dá)最高，腫瘤組織中肝癌組織表達(dá)最高。這充分說明DHTKD1在能量代謝中發(fā)揮著重要的作用，DHTKD1基因突變導(dǎo)致的其功能的缺陷對線粒體、細(xì)胞以及機(jī)體造成重大影響。

1 DHTKD1基因突變與人類疾病的關(guān)系

1.1 DHTKD1基因突變與CMT

CMT是一種較常見的遺傳性周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病, 該病在人群中的發(fā)病率約為萬分之四[11]。該病主要呈常染色體顯性遺傳(autosomal dominant, AD)，也可呈常染色體隱性遺傳(autosomal recessive, AR)及X連鎖顯性遺傳(X-linked dominant, XD)或X連鎖隱性遺傳(X-linked recessive, XR)[11]。CMT患者在患病初期往往表現(xiàn)出弓形足及杵狀指，由于下肢無力而呈現(xiàn)跨越步態(tài)。隨著疾病的進(jìn)展，部分患者出現(xiàn)手部肌肉無力和萎縮，造成精細(xì)動作困難。末端神經(jīng)功能的喪失還會導(dǎo)致感覺功能減退。該病大多在青少年期起病，也可延遲至中年起病[11]。迄今為止，已報(bào)道[12]有50多個(gè)基因與CMT的發(fā)生相關(guān)，其中外周髓鞘蛋白22(PMP-22)、髓鞘蛋白零(MPZ)、間隙連接蛋白32(Cx32)異常是導(dǎo)致CMT的常見致病基因。

表 1 DHTKD1基因突變位點(diǎn)及相關(guān)疾病

2012年，Xu等[2]研究人員在一個(gè)常染色體顯性遺傳的中國人CMT家系中鑒定出DHTKD1基因第8外顯子cDNA序列1 455個(gè)核苷酸由T 變?yōu)镚，導(dǎo)致該三聯(lián)密碼子編碼的氨基酸由絲氨酸變?yōu)榻K止密碼子?；颊弑憩F(xiàn)為不同程度的以下肢為重、并累及上肢的肢體遠(yuǎn)端肌肉萎縮和無力，但無明顯感覺障礙。體外實(shí)驗(yàn)證明無義突變造成mRNA穩(wěn)定性的下降，由此產(chǎn)生的單倍型不足效應(yīng)造成正常蛋白質(zhì)量的減少，從而引起臨床表型。同時(shí)，Dhtkd1基因敲除小鼠具有嚴(yán)重的代謝紊亂、線粒體功能障礙以及典型的CMT表型[10]。

1.2 DHTKD1基因突變與AMOXAD

賴氨酸代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程, 涉及線粒體、細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體等。AMOXAD是一種常染色體隱性遺傳的先天性代謝性疾病，多由賴氨酸、羥賴氨酸和色氨酸代謝通路上的酶缺陷導(dǎo)致疾病的發(fā)生，臨床上以在病人尿中檢測出過量的2-氨基己二酸(2-AAA)和2-酮己二酸(2-KAA)為特征。AMOXAD的臨床表現(xiàn)紛繁多樣，迄今發(fā)現(xiàn)的20多個(gè)患者中，一半以上是沒有明顯可見的臨床表型，其他人則表現(xiàn)為不同程度的腦發(fā)育遲緩、早期發(fā)育緩慢、代謝性酸中毒、共濟(jì)失調(diào)、驚厥、癲癇、肌張力減退、運(yùn)動功能障礙等[13,14]。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)在DHTKD1上的多個(gè)突變與AMOXAD的發(fā)生有關(guān)。最常見的是c.2185G＞A(p.G729R)和 c.1364G＞A (p.R455Q)。突變的DHTKD1單倍型不足，表達(dá)降低甚至功能缺失，使得賴氨酸代謝中間產(chǎn)物2-AAA和2-KAA在體內(nèi)積累,最終導(dǎo)致酸尿癥[1,3,4]。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，Dhtkd1基因缺失導(dǎo)致小鼠尿液中2-AAA和2-KAA顯著升高[10],說明Dhtkd1缺失的確阻斷了2-KAA向戊二酰輔酶A的反應(yīng)過程。

1.3 DHTKD1基因突變與EoE

EoE是一種慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病。嬰幼兒患者表現(xiàn)為嘔吐, 營養(yǎng)不良性發(fā)育緩慢。成年患者表現(xiàn)為吞咽困難及食物嵌塞[15,16]。越來越多的研究[17,18]表明EoE是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。大多數(shù)遺傳學(xué)研究[19,20]都集中在染色體2p23和5q22上的常見遺傳變異及連鎖分析上?；虮磉_(dá)譜和免疫學(xué)分析表明[21,22]，該疾病是強(qiáng)烈的2型免疫相關(guān)炎癥反應(yīng)過程。最近，研究人員利用全外顯子測序鑒定出DHTKD1基因的多個(gè)突變與EoE有關(guān)。進(jìn)一步研究表明，DHTKD1缺失導(dǎo)致食管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙，活性氧升高以及Viperin表達(dá)升高[5]。Viperin與T細(xì)胞中Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)[23]。

2 Dhtkd1基因敲除小鼠模型

基因敲除小鼠模型是在體研究基因功能的理想工具。由于對DHTKD1的研究目前還處于起步階段,僅有Xu等以及德國的Biagosch等構(gòu)建了Dhtkd1的基因敲除小鼠[10,24]。但是2種基因敲除小鼠有明顯的不同, 包括敲除策略以及最后產(chǎn)生的表型均不相同。

2.1 Dhtkd1基因敲除方法及策略

為了使小鼠模型盡可能的模擬人類AMOXAD患者所攜帶的c.1228C＞T (p.Arg410*)突變, Biagosch等[24]用TALEN(transcription activator like effector nucleases)技術(shù)敲除小鼠Dhtkd1第7外顯子上的片段。結(jié)果該小鼠仍然表達(dá)Dhtkd1蛋白N端431個(gè)氨基酸多肽。也許正是這個(gè)長431個(gè)氨基酸的肽段在小鼠體內(nèi)發(fā)揮作用。Xu等[10]用傳統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)敲除Dhtkd1第2到4外顯子, 并產(chǎn)生移碼, 最終小鼠體內(nèi)只可能產(chǎn)生55個(gè)氨基酸的多肽。這是兩種小鼠表型差異的根本原因。

2.2 Dhtkd1基因敲除小鼠模型表型

Biagosch等[24]得到的Dhtkd1的基因敲除小鼠(Dhtkd1p431*)3月齡時(shí)，無論是握力分析、倒置格柵還是平衡木分析，與野生型小鼠表現(xiàn)無異。這與DHTKD1突變的氨己二酸酮己二酸尿癥患者輕微甚至無癥狀的表現(xiàn)一致。生化檢測Dhtkd1431*小鼠2-AAA和2-KAA在肝臟中明顯升高。這與DHTKD1突變的AMOXAD患者也是相符合的。Xu等[10]構(gòu)建的小鼠(Dhtkd1p55*)具有典型的CMT表型，包括肢體遠(yuǎn)端運(yùn)動性肌無力和萎縮、感覺功能障礙，并伴有神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降。此外，DHTKD1缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝異常，尿中2-AAA和2-KAA顯著增加。

2.3 Dhtkd1基因敲除小鼠模型優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用

Dhtkd1p431*和Dhtkd1p55*小鼠體內(nèi)2-AAA和2-KAA均有不同程度的升高, 進(jìn)一步驗(yàn)證了DHTKD1是氨基酸代謝通路上的氧化還原酶。Dhtkd1p431*小鼠模擬了AMOXAD患者體內(nèi)點(diǎn)突變, 可以用來研究DHTKD1蛋白N端及C端結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性[24]。Dhtkd1p55*小鼠可以用來研究DHTKD1整個(gè)蛋白的功能，包括其在神經(jīng)系統(tǒng)能量代謝中的作用[10]。Dhtkd1p431*小鼠與野生型小鼠的比較研究可以用來闡明DHTKD1蛋白C端結(jié)構(gòu)域的功能，而Dhtkd1p431*小鼠與Dhtkd1p55*小鼠的比較研究可以用來闡明DHTKD1蛋白N端結(jié)構(gòu)域的功能。而針對DHTKD1蛋白不同結(jié)構(gòu)域的研究，可以表明DHTKD1蛋白不同結(jié)構(gòu)域的不同功能，比如催化位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)等，進(jìn)而可以針對不同的位點(diǎn)開發(fā)設(shè)計(jì)抑制或拮抗性藥物[10,24]。

另外，一種現(xiàn)有的DHTKD1基因相關(guān)的小鼠模型是郭文婷[25]報(bào)道的Dhtkd1Y486*基因敲入小鼠模型，該模型完全模擬了人類CMT 2Q中DHTKD1 c.1455T＞G (p.Tyr485*)突變，由于該小鼠模型突變位點(diǎn)與D h t k d 1 p 4 3 1*小鼠突變位點(diǎn)較近，Dhtkd1Y486*小鼠只是在超微結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出了類似CMT的表型，并沒有表現(xiàn)出類似CMT2Q患者的嚴(yán)重癥狀[25,26]。

總之, Dhtkd1p55*小鼠適用于在體研究DHTKD1的功能，而要進(jìn)一步研究DHTKD1關(guān)鍵位點(diǎn)的作用或者DHTKD1有關(guān)點(diǎn)突變導(dǎo)致AMOXAD的機(jī)理,需要使用相關(guān)點(diǎn)突變的基因敲入小鼠，比如Dhtkd1p431*和Dhtkd1Y486*等。但是, 尚不清楚點(diǎn)突變的基因敲入小鼠是否會與Dhtkd1p431*和Dhtkd1Y486*小鼠一樣無明顯癥狀。

3 小結(jié)和展望

研究表明[8]，DHTKD1與線粒體功能密切相關(guān)。DHTKD1沉默的細(xì)胞中ATP減少，活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。以上這三種疾病的發(fā)生也與線粒體息息相關(guān)。線粒體存在于所有的組織細(xì)胞中，那么DHTKD1導(dǎo)致的線粒體障礙是否影響其他的組織細(xì)胞呢？DHTKD1在肝臟中表達(dá)最高，肝臟的生理功能以及肝癌的發(fā)生可能與DHTKD1有關(guān), 包括肝臟損傷后的修復(fù)以及肝臟再生的潛能。DHTKD1在脊髓中的表達(dá)相對較高，這是否與脊髓的損傷修復(fù)有關(guān)？是否與神經(jīng)元的再生有關(guān)？另外，DHTKD1還在乳腺組織高表達(dá)，癌細(xì)胞的快速增殖是能量高度依賴性的，那么肝癌以及乳腺癌甚至其他癌癥類型可能與DHTKD1介導(dǎo)的能量代謝密切相關(guān)。這些問題都有待在以后的研究中進(jìn)一步探索。Dhtkd1基因敲除小鼠完全模擬了CMT及AMOXAD[10]，為深入研究這兩種疾病的發(fā)病機(jī)制提供了條件，為探索DHTKD1在其他組織器官中的作用提供了可靠的工具。

綜上所述，這些研究為我們揭示了DHTKD1中罕見突變導(dǎo)致的線粒體功能缺陷潛在危險(xiǎn)因素，也為我們提供了遺傳疾病中存在的罕見的遺傳變異的多樣性，并強(qiáng)調(diào)了相關(guān)表型的遺傳復(fù)雜性。