徐豪丁云暉張英邱明豐

1上海交通大學(xué)藥學(xué)院 （上海 200240） 2上海上藥中西制藥有限公司 （上海 201806）

度洛西汀由美國Eli Lilly公司[1]首先開發(fā)上市，通常以鹽酸鹽的形式被使用，度洛西汀現(xiàn)已廣泛用于治療重度抑郁癥、廣泛性焦慮障礙、糖尿病周圍神經(jīng)痛、纖維肌痛、慢性肌肉骨骼疼痛，以及婦女中至重度應(yīng)激性尿失禁癥[2]。度洛西汀抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-羥色胺和去甲腎上腺素（NE）的再攝取。度洛西汀通過抑制去甲腎上腺素再攝取泵（NET），使多巴胺（DA）在前額葉皮質(zhì)增加，而多巴胺再攝取泵很少，因而它被認(rèn)為能夠介導(dǎo)多巴胺和去甲腎上腺素的再攝取[3]。度洛西汀對多巴胺能、膽堿能、組胺能、阿片類、谷氨酸和GABA再攝取轉(zhuǎn)運蛋白沒有明顯的親和力，因此被認(rèn)為是5-羥色胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體的選擇性再攝取抑制劑。度洛西汀代謝廣泛，但主要循環(huán)代謝產(chǎn)物不具有顯著的藥理活性[4,5]。

文獻資料表明，關(guān)于鹽酸度洛西汀腸溶膠囊臨床研究的文章較多，但關(guān)于其制劑產(chǎn)品檢驗方法的研究較少。本研究擬建立一個檢測時間短且使用的溶劑相對環(huán)保的度洛西汀有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1100及1200型高效液相色譜儀、紫外檢測器、1200型DAD檢測器（圖像二極管陳列檢測器）和色譜工作站，安捷倫科技有限公司；AL 104電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司。

鹽酸度洛西汀工作用對照品（批號：20170509，含量 99.86%）；α-萘酚（雜質(zhì)Ⅲ），批號為 20160628；(3s)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(3-噻吩基)丙胺[雜質(zhì)Ⅴ（3-異構(gòu)體）]，批號為 RO32WO，USP 標(biāo)準(zhǔn)品；(s)-4-{甲基[3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)丙基]氨基}-4-氧代丁酸 [雜質(zhì)Ⅷ（N-琥珀酰度洛西?。，批號為RO32XO，USP標(biāo)準(zhǔn)品；鹽酸度洛西汀腸溶膠囊，自制，批號為 T170901，T170902，T171001 及 T171002。

甲醇，色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純），永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸（分析純）、三乙胺（分析純）、氫氧化鉀（分析純）、四氫呋喃（色譜純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；純化水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZorbaxSB-C8（4.6mm×75mm，3.5 μm）或效能相當(dāng)?shù)纳V柱，辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀3.4 g與三乙胺15 mL，加1 000 mL水使其溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至 5.5）-甲醇-四氫呋喃（體積比為 587∶323∶90）；流速：1.5 mL/min；紫外檢測波長：230 nm；進樣量：10 μL；柱溫：45℃；出峰順序：度洛西汀峰、雜質(zhì)Ⅴ峰、雜質(zhì)Ⅲ峰與雜質(zhì)Ⅷ峰；理論板數(shù)：不低于2500。

1.2.2 溶液配制

（1）溶劑

取流動相1000 mL，加入60%氫氧化鉀溶液10 mL，搖勻，調(diào)節(jié)pH至10.0。

（2）供試品溶液

臨用新制。取本品內(nèi)容物適量（約相當(dāng)于度洛西汀100 mg），置于100 mL量瓶中，加溶劑適量，機械振搖至分散均勻，再超聲10 min使溶解，放冷；用溶劑稀釋至刻度，搖勻，離心，取上層清液濾過；精密量取續(xù)濾液5 mL，置于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋到刻度，搖勻，作為供試品溶液。

（3）靈敏度溶液

精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL稀釋液置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液。

（4）系統(tǒng)適用性溶液

取鹽酸度洛西汀對照品約11 mg、雜質(zhì)Ⅴ對照品約1.0 mg、雜質(zhì)Ⅲ對照品約5.0 mg、雜質(zhì)Ⅷ對照品約2.5 mg，同置于100 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。1.2.3 專屬性實驗

（1）樣品

稱取對照品適量 (約相當(dāng)于鹽酸度洛西汀22.4 mg)，置于200 mL量瓶中，加入處方量的輔料。

酸破壞試驗：加入1 mL 2 mol/L的鹽酸溶液，放置2 h，加2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，作為酸破壞試驗樣品。

堿破壞試驗：加入1 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液，放置5 h，加2 mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH至中性，作為堿破壞試驗樣品。

氧化破壞試驗：加入1 mL 30%雙氧水，放置5 h，作為氧化破壞試驗樣品。

光照破壞試驗：在4 500 lx下照射22 h，作為光照破壞試驗樣品。

高溫破壞試驗：在100℃下加熱5 h，作為高溫破壞試驗樣品。

上述樣品均加溶劑適量，機械振搖至分散均勻，再超聲處理10 min使溶解，放冷，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，離心，濾過，取續(xù)濾液進樣，記錄色譜圖。

（2）空白輔料

取空白輔料適量，置于100 mL量瓶中，采用上述樣品專屬性試驗方法，對空白輔料用強光照射、高溫、酸水解、堿水解和氧化的方法進行加速破壞，處理后的樣品取續(xù)濾液進行高效液相色譜（HPLC）分析，以研究輔料是否干擾樣品有關(guān)物質(zhì)的檢查。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 檢測波長的選擇

取系統(tǒng)適用性溶液，進行DAD掃描，結(jié)果表明各雜質(zhì)和鹽酸度洛西汀均在230 nm處有最大紫外吸收，故選擇230 nm為紫外檢測波長。

2.1.2 系統(tǒng)適用性試驗

取系統(tǒng)適用性溶液進樣測定，在上述色譜條件下，理論板數(shù)按度洛西汀計為6 255，度洛西汀峰與雜質(zhì)Ⅴ峰、雜質(zhì)Ⅲ峰及雜質(zhì)Ⅷ峰之間的分離度分別為 2.32，3.36 和 11.48。

2.1.3 輔料干擾

空白輔料在主峰之前出峰，不干擾主藥的測定。

2.1.4 檢測限與定量限

精密稱取鹽酸度洛西汀、雜質(zhì)Ⅲ及雜質(zhì)Ⅷ對照品，分別稀釋后進樣測定，按信噪比S/N=3±1計算檢測限，按信噪比S/N=10±1計算定量限（見表1）。由表1可知，雜質(zhì)Ⅲ，雜質(zhì)Ⅷ及鹽酸度洛西汀的檢測限分別為 0.940，2.392，0.050 ng/mL，定量限分別為2.400，8.320，2.171 ng/mL。

表1 定量限與檢測限

2.1.5 線性關(guān)系

精密稱取鹽酸度洛西汀對照品適量，加溶劑適量使其溶解；分別精密稱取雜質(zhì)Ⅲ與雜質(zhì)Ⅷ對照品適量，用1 mL甲醇溶解。用溶劑稀釋成數(shù)個不同質(zhì)量濃度的供試品溶液。精密吸取10 μL注入液相色譜儀中測定，結(jié)果見表2。

度洛西汀的質(zhì)量濃度與峰面積在38.8～155.2 μg/mL(r=1.0000，n=8)內(nèi)線性關(guān)系良好，而雜質(zhì)Ⅲ和Ⅷ的質(zhì)量濃度與峰面積分別在0.08～0.33 μg/mL(r=0.9999，n=8) 和 0.08～0.32 μg/mL(r=0.9997，n=8)內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 鹽酸度洛西汀及各有關(guān)物質(zhì)線性關(guān)系表

2.1.6 校正因子

以表2中的線性方程計算雜質(zhì)Ⅲ和Ⅷ相對于鹽酸度洛西汀的校正因子，結(jié)果顯示：雜質(zhì)Ⅲ與雜質(zhì)Ⅷ的校正因子均在0.2～5.0之間，但雜質(zhì)Ⅲ的校正因子在0.9～1.1之外[6]（表2）。故可以采用加校正因子主成分自身對照法計算不在范圍內(nèi)的雜質(zhì)Ⅲ的含量，相對校正因子可確定為1.7。

2.1.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品的供試品溶液、對照溶液各6份進行HPLC測定，經(jīng)計算雜質(zhì)總量平均為0.08%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.9%，具有良好的重復(fù)性。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗

取同一批號供試品溶液，在 0，4，8，12，16，20，24 h時進樣測定，考察供試品中主峰峰面積的穩(wěn)定性。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)主峰沒有降解，溶液基本穩(wěn)定（見表3）。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.1.9 回收率試驗

精密稱取鹽酸度洛西汀對照品適量，按處方量加入輔料，加溶劑溶解并稀釋至相關(guān)對照物質(zhì)溶液質(zhì)量濃度（20%為基準(zhǔn)）的80%，100%，120%。精密稱取雜質(zhì)Ⅲ、雜質(zhì)Ⅷ對照品適量，按處方量加入輔料，加1 mL甲醇溶解，并用溶劑分別稀釋至相關(guān)對照物質(zhì)溶液質(zhì)量濃度（20%為基準(zhǔn)）的40%，60%，80%，100%，120%，140%及 160%。精密量取 10 μL注入液相色譜儀中，按外標(biāo)法以峰面積計算雜質(zhì)Ⅲ，雜質(zhì)Ⅷ及鹽酸度洛西汀的測得量和回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，雜質(zhì)Ⅲ，雜質(zhì)Ⅷ與鹽酸度洛西汀的RSD分別為0.64%，1.62%和0.70%，表明3種物質(zhì)的回收率良好。

表4 回收率及RSD結(jié)果匯總

2.1.10 專屬性試驗

對破壞后的樣品進行HPLC分析，結(jié)果（見表5）表明：鹽酸度洛西汀腸溶膠囊在酸、氧化破壞中有明顯降解，在堿、光照和高溫條件下表現(xiàn)較穩(wěn)定；各破壞條件下物料守恒，產(chǎn)生的雜質(zhì)峰能與主峰有效分離，經(jīng)破壞后的空白輔料溶液均不干擾樣品中雜質(zhì)的檢測。說明該色譜條件專屬性較強，可有效檢出各破壞的雜質(zhì)。

表5 各強制降解試驗雜質(zhì)含量 %

2.1.11 耐用性試驗

取同一批供試品溶液各 10 μL，分別于1.4，1.5，1.6 mL/min流速下進樣，測定的有關(guān)物質(zhì)結(jié)果分別為0.05%，0.06%，0.06%；在流動相V（磷酸鹽緩沖液）：V（甲醇）：V（四氫呋喃）分別為 575∶335∶90，587∶323∶90 與 600∶310∶90 的條件下進樣，所測定的有關(guān)物質(zhì)結(jié)果分別為0.07%，0.06%及0.06%；將色譜柱更換為DikmaInertsilC8（4.6 mm×75 mm，3 μm），測定的有關(guān)物質(zhì)結(jié)果為0.05%。上述試驗結(jié)果表明該方法的系統(tǒng)耐用性良好。

2.2 有關(guān)物質(zhì)的檢測

按自身對照法檢測并計算4批樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果如表6所示。由表6可以看出，4批樣品中雜質(zhì)Ⅲ和Ⅷ的含量均小于0.20%，總雜質(zhì)含量均小于0.4%。

表6 4批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 結(jié)論

（1）鹽酸度洛西汀在氧化、強酸條件下容易降解；在強堿、高溫、光照條件下相對比較穩(wěn)定，降解樣品的主峰峰純度符合要求，且質(zhì)量守恒在90%～110%之間。

（2）雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅷ是鹽酸度洛西汀的主要降解產(chǎn)物，該降解易受酸和氧化等條件的影響。

（3）對度洛西汀有關(guān)物質(zhì)的檢查方法進行方法學(xué)驗證，結(jié)果表明該方法能較好地分離雜質(zhì)峰與主峰，并能夠定量雜質(zhì)。該色譜條件系統(tǒng)適用性、精密度、專屬性、線性、溶液穩(wěn)定性均良好。該方法樣品前處理簡單、分析儀器普及率高，檢測簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，驗證內(nèi)容符合藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則附錄[7]，且驗證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，能夠客觀地反映制劑中的雜質(zhì)情況，適用于鹽酸度洛西汀腸溶膠囊的質(zhì)量控制。