程志，吳佳蔚，王一婷，王璐，關(guān)國(guó)平

東華大學(xué)紡織學(xué)院，紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海，201620)

【關(guān)健詞】 人工韌帶； 絲素纖維； 多巴胺； 表面改性； 礦化

0 引言

在劇烈運(yùn)動(dòng)及意外情況下，人體韌帶常由于過(guò)度受力而發(fā)生挫傷、斷裂或缺損[1-2]。對(duì)于輕度的挫傷或撕裂，通常采用物理康復(fù)或藥物治療。而對(duì)于韌帶斷裂及缺損的病例，人工韌帶移植則是主要治療方法[3]。據(jù)調(diào)查，美國(guó)每年約有10萬(wàn)～15萬(wàn)例病患需接受前交叉韌帶重建手術(shù)，以恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的正常結(jié)構(gòu)和功能[4]。目前臨床可使用的人工韌帶是以LARS為代表的人工合成材料人工韌帶， 多屬于生物“惰性”材料，不能為種子細(xì)胞提供良好的生物界面。因此，人工韌帶在骨髓道中愈合效果不理想，移植物與骨界面之間易分離或形成疤痕組織[5-6]。因此，為了提高愈合效果，人工韌帶表面涂層、接枝等改性研究日益增加，期望提高材料表面礦化效果[7]。

絲素蛋白纖維具有良好的力學(xué)性能、生物相容性和可降解性能，用作外科縫合線已有上百年歷史，是生物材料領(lǐng)域最有發(fā)展前景的材料之一[8]。開(kāi)發(fā)絲素蛋白纖維人工韌帶，有望同時(shí)滿足對(duì)新型人工韌帶材料力學(xué)性能、生物相容性及生物降解性等方面的要求。為了提高絲素蛋白纖維材料表面的生物礦化及骨愈合能力，可采用貽貝仿生材料多巴胺對(duì)其表面進(jìn)行改性[9-10]。在弱堿性條件下，多巴胺可以在濕態(tài)下發(fā)生氧化自聚反應(yīng)，其自聚產(chǎn)物聚多巴胺(pDA)能夠牢固附著在固體基質(zhì)表面，且具有優(yōu)良的生物相容性[11-12]。此外，pDA結(jié)構(gòu)中含有大量的酚羥基和氨基，能與有機(jī)分子或聚合物發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)和席夫堿反應(yīng)[15-16]，并將生物活性分子引入到材料表面以促進(jìn)有機(jī)基質(zhì)礦化[13-14]。因此，本研究擬采用編織方法成型絲素纖維人工韌帶，采用多巴胺溶液進(jìn)行改性而獲得具有體外礦化性能的人工韌帶材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑蠶絲(線密度為80支，天津彩虹線業(yè))； 鹽酸多巴胺(分析純，美國(guó)Sigma)； 氯化鈣(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)； 無(wú)水碳酸鈉、磷酸氫二鈉和三(羥甲基)氨基甲烷(均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； L929成纖維細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所)。TP-114精密電子天平(丹佛儀器有限公司)； HYG-B全溫?fù)u瓶柜； Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher)； HD-300低溫等離子處理儀(常州中科常泰等離子體科技有限公司)； JSM-5600LV掃描電子顯微鏡(JEOL日本電子株式會(huì)社)； DL-2003(16)常溫震蕩染色試驗(yàn)機(jī)(蘇州絲達(dá)樂(lè)印染機(jī)械有限公司)； Quanta250環(huán)境掃描電子顯微鏡； C12錠編織機(jī)(上海哈考線帶設(shè)備有限公司)；DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)； S-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡； Escalab 250Xi X射線光電子能譜儀； MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)； D/max-2550VB+/PC 18 kW轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀(日本)。

1.2 人工韌帶的設(shè)計(jì)與成型

參考人工韌帶臨床移植術(shù)式及LARS?人工韌帶結(jié)構(gòu)，將人工韌帶設(shè)計(jì)為兩端緊密中間疏松的結(jié)構(gòu)，以保證人工韌帶具有足夠的力學(xué)性能和關(guān)節(jié)腔內(nèi)的靈活性。將兩端長(zhǎng)度定為50～70 mm，中間長(zhǎng)度定為20～30 mm。采用絲素纖維股線為原材料，在C12錠編織機(jī)上編織成型絲素纖維人工韌帶材料(SF)。制備絲素纖維的方法為，利用震蕩染色機(jī)進(jìn)行桑蠶絲纖維的脫膠，采用濃度為0.5%的碳酸鈉水溶液，在溫度為98 ℃條件下，對(duì)桑蠶絲脫膠30 min。脫膠后進(jìn)行快速清洗。重復(fù)3次后低溫干燥[15]。

1.3 多巴胺涂層[11]

在真空度為10 Pa，放電功率為100 W，放電時(shí)間為120 s的參數(shù)下，用氧氣等離子體對(duì)SF表面進(jìn)行處理[16]。隨后立刻浸入濃度為2.5 mg/mL的多巴胺溶液中20 h，溫度26 ℃，pH 8.5。取出后去離子水清洗，室溫下真空干燥24 h，得到聚多巴胺涂層的絲素纖維人工韌帶材料(SF-pDA)。

1.4 體外礦化[17]

將SF組和SF-pDA組樣品分別浸入裝有200 mM/L CaCl2溶液的燒杯中，燒杯置于37 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床上振蕩1 h。再將樣品轉(zhuǎn)移到濾紙上除去多余的水分，隨后浸入120 mM/L的Na2HPO4溶液中，同上振蕩1 h。交替浸泡4個(gè)周期后，去離子水洗凈，室溫下真空干燥24 h，得到礦化的絲素纖維人工韌帶材料(SF-ACP)和礦化的聚多巴胺涂層絲素纖維人工韌帶材料(SF-pDA-ACP)。

1.5 掃描電子顯微鏡觀察

采用S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)SF、SF-pDA、SF-ACP和SF-pDA-ACP四組材料進(jìn)行表面形貌觀察，加速電壓為5 kV。

1.6 傅里葉紅外光譜測(cè)試

采用Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，通過(guò)ATR衰減全反射法，對(duì)SF、SF-ACP、SF-pDA和SF-pDA-ACP四組樣品進(jìn)行測(cè)試，掃描范圍500～4 000 cm-1。

1.7 X射線光電子能譜測(cè)試

采用Escalab 250Xi 型X射線光電子能譜儀，對(duì)SF和SF-pDA的C、N、O元素進(jìn)行定量測(cè)試。測(cè)試條件為：ALKa(hv=1 486.6 eV)，全譜掃描時(shí)通能為187.85 eV、窄譜掃描時(shí)通能為29.35 eV，Cls電子結(jié)合能284.6 eV校準(zhǔn)荷電效應(yīng)。

1.8 X射線能譜測(cè)試

采用Quanta250環(huán)境掃描電子顯微鏡對(duì)SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca、P元素進(jìn)行能譜定量分析(EDS)，加速電壓為10 kV。

1.9 X射線衍射測(cè)試

采用D/max-2550VB+/PC*18KW轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀，對(duì)材料表面礦化的磷酸鹽晶型進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件為，Cu陽(yáng)極靶射線，電壓為40 kV，電流為200 mA，起始角為2°，終止角為50°，掃描速度為12°/min。

1.10 細(xì)胞活性

將SF、SF-pDA兩種人工韌帶材料滅菌后放入24孔板中(n=3)，種植L929成纖維細(xì)胞后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1、4和7 d后取出24孔板，每孔加入100 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將每孔中的溶液轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100 μL，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組樣品的最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 SD表示，應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間均數(shù)的差異比較采用方差分析法，P<0.05為顯著差異(*)，P<0.01為極顯著差異(**)。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工韌帶形態(tài)結(jié)構(gòu)

本研究編織成型的絲素纖維人工韌帶材料如圖1所示，該人工韌帶共分為三段，具有緊密結(jié)構(gòu)的兩端和疏松結(jié)構(gòu)的中間部分。兩端長(zhǎng)度為(50±7) mm，中間長(zhǎng)度為(28±3) mm。由于編織角越小編織結(jié)構(gòu)就越疏松，因此可通過(guò)調(diào)節(jié)編織角來(lái)控制人工韌帶不同部位的結(jié)構(gòu)。如圖1B所示，將人工韌帶兩端的編織角設(shè)置為(45±2)°時(shí)，結(jié)構(gòu)緊密。由于兩端需要植入骨道內(nèi)用擠壓螺釘固定，故這種緊密結(jié)構(gòu)可以增加纖維與螺釘間的摩擦力，提高固定牢度。如圖1C所示，當(dāng)改變編織角為(30±2)°時(shí)，獲得的中間部分結(jié)構(gòu)較為疏松。由于中間部分將位于關(guān)節(jié)腔，故疏松結(jié)構(gòu)有利于保持關(guān)節(jié)活動(dòng)的靈活性。

圖1 絲素纖維人工韌帶照片(A：正體，B：兩端，C：中間)

2.2 掃描電鏡形貌分析

SF、SF-pDA、SF-ACP和SF-pDA-ACP的SEM結(jié)果如圖2所示。SF的纖維表面光滑(圖2A)，而SF-pDA纖維表面變得粗糙，纖維之間有黏連并且有小顆粒沉積在纖維表面(圖2B)，說(shuō)明pDA已經(jīng)涂層在纖維表面。經(jīng)礦化后，SF-ACP組纖維表面可見(jiàn)明顯的ACP顆粒沉積，但沉積顆粒尺寸及分布不均勻(圖2C)。而經(jīng)pDA涂層后的SF-pDA-ACP組，礦化后纖維表面可見(jiàn)大量ACP沉積，且包覆整個(gè)纖維表面(圖2D)。這是由于pDA形成的均勻薄膜使得Ca元素可以通過(guò)與pDA薄膜結(jié)合的方式，均勻地覆蓋在SF-pDA-ACP表面，從而促進(jìn)有機(jī)基質(zhì)礦化[18]，提高了ACP生成的量?？梢?jiàn)，pDA涂層可使得SF-pDA-ACP表面的礦化層更加均勻，礦化效果得到提高。

圖2 SF(A)、SF-pDA(B)、SF-ACP(C)和SF-pDA-ACP(D)SEM結(jié)果Fig.2 SEM images of SF(A)，SF-pDA(B)，SF-ACP(C)and SF-pDA-ACP(D)

2.3 紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜儀分別對(duì)四組人工韌帶材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖3所示。SF組在1 623 cm-1和1 510 cm-1出現(xiàn)β-sheet結(jié)構(gòu)中的酰胺Ⅰ與酰胺Ⅱ的特征峰，1 228 cm-1出現(xiàn)silk-Ⅰ型結(jié)構(gòu)中酰胺Ⅲ吸收峰[19-20]。而SF-pDA組在1 514 cm-1和1 619 cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)新峰，前者對(duì)應(yīng)于pDA吲哚結(jié)構(gòu)中N-H的彎曲振動(dòng)，后者來(lái)源于pDA的苯環(huán)骨架振動(dòng)。但由于pDA的涂層量較少，且pDA的兩個(gè)特征峰與SF的特征峰位置接近，導(dǎo)致SF和SF-pDA的紅外圖相似，但可以看出，在1 619 cm-1處SF與pDA的峰疊加，使得該處峰強(qiáng)度加深。而且，SF-ACP和SF-pDA-ACP均在602 cm-1和691 cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰，為PO43-基團(tuán)的彎曲振動(dòng)峰[21]，SF-ACP在1 027 cm-1處出現(xiàn)P-O基團(tuán)的特征吸收峰[18]，1 513 cm-1處出現(xiàn)CO3-2基團(tuán)的特征吸收峰。SF-pDA-ACP組在1 044 cm-1處出現(xiàn)P-O基團(tuán)的特征吸收峰，1 520 cm-1處出現(xiàn)CO3-2基團(tuán)的特征吸收峰。這些結(jié)果表明，磷酸鈣化合物沉積在SF和SF-pDA表面。

圖3 SF、SF-ACP、SF-pDA和SF-pDA-ACP的FTIR結(jié)果Fig.3 FTIR spectra of SF，SF-ACP，SF-pDA and SF-pDA-ACP

2.4 X射線光電子能譜分析

在FTIR圖譜中，由于SF與SF-pDA的差異不明顯，為了進(jìn)一步確認(rèn)pDA在SF表面的存在，對(duì)SF和SF-pDA進(jìn)行XPS測(cè)試，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，與SF相比，經(jīng)過(guò)pDA涂層后，SF-pDA的C、N、O元素百分比、N/C比及O/C比均介于DA值與SF值之間，說(shuō)明pDA涂層已經(jīng)存在于SF表面。

表1 XPS分析絲素纖維與聚多巴胺涂層絲素纖維表面的化學(xué)組成

2.5 X射線能譜分析

采用環(huán)境掃描電子顯微鏡對(duì)SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca、P元素進(jìn)行能譜定量分析，測(cè)得Ca:P摩爾比均為1.57，接近人體天然骨的Ca:P摩爾比[22]。有研究表明[23]，Ca2+是磷酸鈣表面吸附成骨細(xì)胞配體蛋白的活性位，因此礦化層Ca元素含量越高，越有利于成骨細(xì)胞的粘附增殖，促進(jìn)新生骨生成，縮短移植物與骨的愈合過(guò)程。圖4為SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca元素分析結(jié)果?？梢钥闯鯯F-pDA-ACP與SF-pDA表面礦化層的Ca元素含量具有顯著性差異(P<0.01)，SF-pDA-ACP的Ca元素占比要明顯高于SF-ACP。這是由于pDA本身帶有的酚羥基可以與Ca2+共價(jià)結(jié)合[23]，為Ca2+在SF-pDA表面上生長(zhǎng)提供了大量的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，pDA涂層提高了SF的礦化效果。

圖4 SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca元素含量Fig.4 Ca content on SF-ACP and SF-pDA-ACP

2.6 X射線衍射分析

采用轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀對(duì)礦化后的磷酸鈣晶型進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。可以看出，在30°附近有個(gè)饅頭峰，說(shuō)明得到的產(chǎn)物為無(wú)定型磷酸鈣(ACP)，而在XRD圖譜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他物質(zhì)的衍射峰，說(shuō)明得到的ACP為純相，而且，有研究發(fā)現(xiàn)ACP的骨傳導(dǎo)性以及成骨細(xì)胞粘附性能比羥基磷灰石更佳。因此，本研究采用交替沉積方法礦化生成的ACP可能具有更好的骨愈合效果。

2.7 細(xì)胞活性

通過(guò)在SF和SF-pDA人工韌帶材料上種植L929成纖維細(xì)胞，來(lái)評(píng)價(jià)材料上的細(xì)胞活性，結(jié)果如圖6所示。在培養(yǎng)1 d后，SF，SF-pDA與空白對(duì)照組的細(xì)胞活性無(wú)顯著性差異。在培養(yǎng)4 d后，空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯優(yōu)于SF，而SF-pDA與空白對(duì)照無(wú)顯著性差異。在培養(yǎng)7 d后，空白對(duì)照的吸光度與SF接近，而SF-pDA要明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。這就說(shuō)明，SF與SF-pDA均具有良好的細(xì)胞相容性，經(jīng)pDA涂層后材料的細(xì)胞相容性提高。

圖5 礦化生成磷酸鈣的XRD圖

圖6 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of cell viability

3 結(jié)論

本研究根據(jù)人工韌帶臨床移植術(shù)式需要，設(shè)計(jì)并編織成型了一種三段式雙結(jié)構(gòu)絲素纖維人工韌帶原型。通過(guò)調(diào)節(jié)編織角可對(duì)人工韌帶不同部分的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行調(diào)控。多巴胺涂層可明顯促進(jìn)絲素纖維人工韌帶材料的體外礦化效果，形成無(wú)定形結(jié)構(gòu)的鈣磷鹽。涂層人工韌帶材料具有良好的細(xì)胞相容性。